四种药用真菌体外抗肿瘤活性的初步研究

张 睿

遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099

药用真菌是一类具有药用价值的真菌，即在菌丝体、子实体、菌核或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质多糖、苷类、生物碱、黄酮类及萜类等多种物质，对疾病有预防、抑制或治疗作用[1]。我国地域辽阔，自然条件和生态环境十分复杂，造成了药用真菌种类的多样性，据不完全统计，我国的药用真菌大约500种，其中大型药用真菌约有300多种，但已开发的大型药用真菌只有20至30种[2]。药理研究也集中在降血脂、抗肿瘤、调节机体免疫力、调节新陈代谢等方面[3]，在诸多活性中，抗肿瘤活性最引人关注，且抗肿瘤活性成分主要为多糖、萜类物质、蛋白及生物碱等[4]。研究以斑褐孔菌、裂蹄木层孔菌、苦白蹄、木蹄层孔菌为研究对象，对其石油醚提取物的体外抗肿瘤活性进行初步研究，以期为这四种大型真菌的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

斑褐孔菌 (Fuscoporia punctata)、裂蹄木层孔菌(Phellinus rimosus)、苦白蹄 (Fomitopsis officinalis)、木蹄层孔菌 (Pyropolyporus fomentarius)，采自吉林省敦化市。人肺腺癌细胞A－549由遵义医学院医学与生物学研究中心提供。RPMI－1640培养基、胎牛血清，美国Gibco公司;胰蛋白酶、青霉素、链霉素、Tris碱，美国Amresco公司;磺酰罗丹明、DMSO，美国Sigma公司;其余试剂均为分析纯。

R－210型旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司;3131型CO2培养箱、台式离心机、全波长酶标仪，美国Thermo公司;单人超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;Ti－S倒置相差显微镜，日本Nikon公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石油醚提取物的制备 真菌子实体60℃烘干、粉碎、称取粉末100g，加1L石油醚60℃连续回流提取两次，每次3h。合并提取液，旋转蒸发除去溶剂得浸膏，60℃烘干后得样品斑褐孔菌石油醚提取物 (PEFP)、裂蹄木层孔菌石油醚提取物 (PEPR)、苦白蹄石油醚提取物 (PEFO)、木蹄层孔菌石油醚提取物 (PEPF)。精密称取样品10mg，用100μL DMSO溶解，临用前用完全培养基稀释成所需浓度。

1.2.2 细胞培养 人肺腺癌细胞A－549用RPMI－1640完全培养基 (含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)于37℃、5%CO2培养箱常规培养。

1.2.3 SRB法测定提取物对肿瘤细胞增殖的影响 参照文献[5]方法略有改动。取对数生长期A－549细胞，消化后调整细胞浓度为10000个/mL，每种细胞平行接种两块96孔板，分别为对照板 (T0)和实验板 (T)。每孔加入细胞悬液100 μL，置培养箱培养16h后，对照板细胞用预冷的50%三氯乙酸 (TCA)固定，待测;同时实验板中加入100μL的提取物 (调节终浓度分别为10、20、40、60、80、100 μg/mL)，阴性对照孔 (C)加入含有相同浓度 DMSO的培养基。每组设5个复孔，继续培养48h后取出培养板，50%的TCA 4℃固定1h，去离子水洗板，自然干燥，SRB染色，10min后用0.1%醋酸洗板，自然干燥，200μL Tris液溶解，530nm处测吸光度值 (OD值)，按下列公式计算生长抑制率。并采用寇氏改良法计算各提取物对A－549的半数抑制浓度 (IC50)。

寇氏改良法计算公式:lgIC50=Xm－I(P－ (3－Pm－Pn)/4)(Xm:lg最大剂量;I:lg(最大剂量/相临剂量);P:阳性反应率之和;Pm:最大阳性反应率;Pn:最小阳性反应率)

2 结果

2.1 对肺癌A－549细胞增殖的影响PEFP、PEFO、PEPR、PEPF作用于人肺腺癌细胞A－549细胞48h以后，对细胞增殖的抑制作用见表1、2。PEFP、PEFO、PEPF对A－549均具有抑制作用，且抑制率随药物浓度的增大而增大，呈剂量依赖关系。其中，PEFP对A－549的抑制作用最强，而PEPR对A－549的增殖没有影响。寇氏改良法计算PEFP、PEFO 对 A －549的 IC50，分别为 55.99μg/mL、67.55μg/mL。

表1 PEFP、PEPR对A－549细胞增殖的影响(±S，n=5)

表1 PEFP、PEPR对A－549细胞增殖的影响(±S，n=5)

注:“－”表示缺省;“*”表示与阴性对照组比较，P＜0.05。下同。

组别 药物浓度(μg/mL)PEFP PEPR OD值 抑制率 (%) OD值 抑制率 (%)对照组 －0.24±0.01 － 0.24±0.01 －阴性对照组 － 1.48±0.03 － 1.53±0.05 －实验组 10 1.14±0.07* 27.42 1.26±0.02* 20.93 20 1.06±0.05* 33.87 1.23±0.06* 23.26 40 0.94±0.04* 43.55 1.19±0.01* 26.36 60 0.71±0.05* 62.10 1.09±0.06* 34.11 80 0.62±0.02* 69.35 0.81±0.06* 55.81 100 0.57±0.03* 73.39 0.67±0.04*66.67

表2 PEPR、PEPF对A－549细胞增殖的影响 (±S，n=5)

表2 PEPR、PEPF对A－549细胞增殖的影响 (±S，n=5)

组别 药物浓度(μg/mL)PEFP PEPR OD值 抑制率 (%) OD值 抑制率 (%)对照组 －0.24±0.01 － 0.24±0.01 －阴性对照组 － 1.48±0.03 － 1.53±0.05 －实验组 10 1.14±0.07* 27.42 1.26±0.02* 20.93 20 1.06±0.05* 33.87 1.23±0.06* 23.26 40 0.94±0.04* 43.55 1.19±0.01* 26.36 60 0.71±0.05* 62.10 1.09±0.06* 34.11 80 0.62±0.02* 69.35 0.81±0.06* 55.81 100 0.57±0.03* 73.39 0.67±0.04*66.67

2.2 斑褐孔菌对肺癌A－549细胞形态的影响 由图1所知，阴性对照组的细胞正常生长，细胞膜完整，形态规则，细胞贴壁紧密;细胞经IC50浓度的PEFP作用48h后，细胞数量明显减少，细胞体积变小，大部分细胞凋亡或坏死，细胞膜破裂，悬浮在培养基中，已经不能见到完整的细胞。

图1 斑褐孔菌石油醚提取物对A－549细胞形态的影响 (×100)

3 结论与讨论

通过斑褐层孔菌、裂蹄木层孔菌、苦白蹄、木蹄层孔菌四种大型多孔类真菌石油醚提取物对人肺癌细胞A－549细胞增殖的实验结果表明，斑褐层孔菌、苦白蹄石油醚提取物对A－549具有较好的抑制效果;木蹄层孔菌的抑制效果不明显;裂蹄层孔菌对A－549没有抑制作用。在后期的研究工作中将会针对活性较好的斑褐层孔菌、苦白蹄的石油醚提取物进行进一步深入研究，希望能发现更有价值的活性组分或单体化合物。

实验采用SRB检测细胞增殖活性，该法是美国国立癌症研究所 (National Cancer Institute，NCI)筛选抗癌药物的一种新方法，能克服MTT法成色反应的时间依赖性，测定结果几乎不随时间而变，不失为一种筛选抗癌药物的好方法。结合药理筛选广泛开展抗肿瘤真菌的基础研究，寻找抗肿瘤活性先导化合物一方面可促进我国丰富真菌资源的开发和利用，另一方面可为抗肿瘤新药的研发提供基础。

[1]徐锦堂.中国药用真菌学[M].北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997.3.

[2]殷培峰，浦冠勤.中国药用真菌研究进展[J].滁州学院学报，2008，10(6):58－60.

[3]王谦，贾震.食药用真菌的药理作用研究进展[J].医药研究与教育，2010，27(5):67－69.

[4]闫黎，许立，李霞.真菌中抗肿瘤活性成分的作用及机制研究进展[J].武警医学院学报，2009，18(8):740－742.

[5]Vanicha Vinchai，Kanyawin Kirtikara.Sulforhodamine Bcolorimetric assay for cytotoxicity screening[J].Nature Protocols，2006，1(3):1112－1116.