肾脏缺血再灌注损伤大鼠肾组织JNK/ATF-2信号通路表达及意义

宋年华，李 丹，徐 岩

(青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003)

肾脏是发生缺血再灌注损伤(IR)极为常见的器官之一，肾移植、严重创伤、休克后延迟复苏会导致不同程度的肾脏IR，甚至可导致急性肾损伤和移植肾功能丧失［1］。c-jun氨基末端激酶(JNK)信号通路作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)超家族成员之一，在肾脏IR中发挥重要的调控作用［2］。JNK及其下游转录因子ATF-2在肾脏IR中的表达尚不清楚。2011年12月～2012年7月，我们观察了肾脏IR大鼠肾小管上皮细胞JNK/ATF-2信号通路的表达变化，探讨其在肾脏IR发生发展中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:Wistar大鼠60只，体质量200～250 g，动物实验室温度22～26℃，相对湿度40% ～60%，24 h昼夜灯光照射管制，清洁级颗粒饲料喂养，自来水饮用。主要试剂 :JNK、ATF-2磷酸化抗体(Santa Cruz公司)，免疫组化试剂盒(青岛沃尔科生物技术公司)，RT-PCR试剂盒(南京凯基公司)，PCR 引物(上海生工)，DMSO(Sigma公司)。实验仪器:显微镜(日本奥林巴斯)、切片机(德国莱卡RM2015)、离心机(北京LDZ5-2)、电子天平(瑞士METTER AE100)、移液器(德国 EPPENDORF)、干燥箱(日本三洋MDF-382E)、低温冰箱(日本三洋MIR-153)、恒温水浴箱(江苏DSHZ-300)、医用微波炉(浙江 YWY781B)、电泳仪(北京 DYY-12)、PCR仪(基因公司PE9600型)、制冰机(上海LQP-B-4)、纯水系统(Millipore公司Biocel)、核酸蛋白分析仪(贝克曼公司DU650)台式高速冷冻离心机(贝克曼64R)、凝胶成像系统(美国伯乐GEL DOC2000)。

1.2 模型制备 将60只大鼠随机分为假手术组(对照组)和缺血再灌注组(IR组)。大鼠适应性喂养1周，术前自由饮食，IR组参照文献［3］，采用夹闭双侧肾动、静脉45 min后去夹再灌注制备IR模型。

1.3 相关指标观察 两组分别于再灌注0、10、30 min及1、24 h各处死大鼠6只，取肾组织4℃预冷生理盐水冲洗，矢状切取一半肾组织(兼顾肾皮髓质)4%甲醛固定，做免疫组化检测;另一半分装置于冻存管于液氮转－80℃保存，留作PCR检测。

1.3.1 肾小管上皮细胞JNK、ATF-2表达 ①磷酸化JNK、ATF-2蛋白表达:采用免疫组化SP法，一抗稀释度均为1∶100，PBS取代一抗作阴性对照。所有切片均在同一放大倍数下，每例随机选取5个高倍视野，观察肾小管上皮细胞JNK、ATF-2蛋白表达情况。结果经Image-Pro Plus分析软件处理，采用免疫组化评分(HIS)进行半定量分析［4］，根据每张切片的阳性细胞面积及阳性细胞显色强度进行分级评分，HIS结果以两项乘积表示。②JNK、ATF-2 mRNA表达:采用RT-PCR法。Trizol法提取肾组织总RNA进行半定量RT-PCR反应。引物序列:β-actin 上游 5'-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3'，下游5'-AGAGGACCTTACGGATGTCAACG-3';JNK上游 5'-ACAGTGAGCAGAGCAGGCATAGTG-3'下游5'-TCCTCCCCAAACAAAATAGAAACCA-3';ATF-2上游 5'-ACGGCAGTGGATTGGTAG-3'，下游 5'-CTTCTTCTGCATGGCGGTTAC-3'。反应条件:预变性:95 ℃、5 min，1 个循环;PCR 反应:98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40个循环;72 ℃ 终延伸 10 min。PCR产物定量:产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化已锭染色，凝胶成像系统扫描 DNA条带，并应用Quantity One4.6软件分析灰度值。目的基因相对表达量以目的基因/β-actin的灰度值表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件行数据处理，数据均以表示，组间比较采用t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 磷酸化JNK、ATF-2蛋白表达 磷酸化JNK蛋白阳性反应主要定位于肾小管上皮细胞胞质，磷酸化ATF-2阳性反应主要定位于肾小管上皮细胞胞核，均呈棕黄色颗粒。对照组磷酸化JNK、ATF-2蛋白未见表达或较低表达;IR组表达明显上调，与Sham 组比较，P 均 ＜0.05，见表1。

表1 两组再灌注不同时间点JNK、ATF-2蛋白表达(n=6，分，)

表1 两组再灌注不同时间点JNK、ATF-2蛋白表达(n=6，分，)

注:与对照组同时点比较，*P＜0.05;与本组不同时间点比较，△P ＜0.05

组别 JNK蛋白 ATF-2蛋白IR 组0 min 2.00 ±1.265* 1.83 ±1.329*10 min 4.67 ±1.033* 3.67 ±1.506*30 min 6.50 ±1.225＊△ 6.17 ±1.602＊△1 h 4.00 ±1.264* 3.50 ±1.761*24 h 3.67 ±1.506* 2.83 ±1.329*对照组0 min 0.33 ±0.516 0.33 ±0.51610 min 0.50 ±0.548 0.67 ±0.51630 min 0.50 ±0.837 1.00 ±0.6321 h 0.83 ±0.753 0.83 ±0.40824 h 0.67 ±0.516 0.83 ±0.753

2.2 JNK、ATF-2 mRNA表达 RT-PCR结果显示，IR组JNK、ATF-2 mRNA表达在早期即有增加，再灌注30 min出现高峰，再灌注1 h表达略减弱，24 h仍有高表达;与假手术组比较，P均＜0.05。见表2。

表2 两组再灌注不同时间点JNK、ATF-2 mRNA表达(n=6，灰度值，)

表2 两组再灌注不同时间点JNK、ATF-2 mRNA表达(n=6，灰度值，)

注:与对照组同时点比较，*P＜0.05;与本组不同时间点比较，△P ＜0.05

组别JNK mRNA ATF-2 mRNA IR 组0 min 0.83 ±0.123* 0.67 ±0.104*10 min 1.58 ±0.259* 1.50 ±0.189*30 min 2.35 ±0.239＊△ 2.23 ±1.194＊△1 h 1.52 ±0.210* 1.38 ±0.174*24 h 1.39 ±0.220* 1.27 ±0.126*对照组0 min 0.22 ±0.056 0.19 ±0.07510 min 0.25 ±0.080 0.22 ±0.08130 min 0.23 ±0.094 0.20 ±0.0691 h 0.24 ±0.077 0.21 ±0.06724 h 0.21 ±0.068 0.21 ±0.072

3 讨论

肾脏是高灌注器官，对缺血及缺血再灌注均较敏感，肾IR是自体肾发生急性肾衰竭的主要原因。JNK信号通路是MAPKs信号转导系统的一条重要通路，IR时其转录在很短时间内(通常为数分钟)被激活，其活化后可调节基因转录，参与细胞生长、发育及凋亡等［5］。ATF-2 又名 m-XBP、CRE-BP1，其作为真核基因特定的转录因子，编码于染色体2q32，隶属于ATF/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)转录因子家族，ATF/CREB转录因子家族包含一段高度保守的5'-TGACGTCA-3'碱基回文结构，称为cAMP效应元件(CRE)［6］。ATF-2是JNK的底物，上游激酶JNK将其磷酸化后成为活性形式而启动下游基因转录，ATF-2包含3个磷酸化位点，即 Thr69、Thr71和Ser90，但Ser90不直接参与转录。磷酸化的ATF-2通过与碱性亮氨酸拉链(b-ZIP)、CRE或激活蛋白-1(AP-1)家族如c-jun、c-fos元件组成异源二聚体的形式发挥转录因子的作用，启动转录过程，调控基因表达［7，8］，其基因的活化产物参与了细胞凋亡，进而损伤肾脏组织的结构和功能。

本研究结果显示，在肾IR早期，肾组织JNK、ATF-2磷酸化蛋白及mRNA的表达水平均显著增加，于再灌注30 min出现高峰，再灌注1 h表达略减弱，24 h仍有高表达，提示磷酸化JNK通过激活下游信号分子ATF-2参与了肾IR的信号调控。因此可通过抑制肾缺血再灌注引起的JNK活化，影响细胞凋亡相关基因的转录及蛋白表达，进而减少肾小管上皮细胞凋亡，减轻肾脏损伤。

目前IR诱发细胞凋亡信号转导机制的研究已取得较大进展，但仍有许多细节尚不清晰。对介导细胞凋亡的信号通路深入研究并明确其机制，可使阻断细胞的死亡通路成为可能，通过干预改变缺血性损伤的程度，对急性肾损伤和移植肾功能丧失的防治将有重大的推动作用。

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