宁夏回汉族人群Wnt3基因单核苷酸多态性与非综合征型唇腭裂相关性的研究

信燕华 马丽娟 翟堃等

[摘要] 目的 探讨宁夏回汉族人群中Wnt3基因rs142167和rs7216231位点单核苷酸多态性（SNP）与非综合征型唇腭裂（NSCL/P）的相关性。方法 收集宁夏地区回汉族人群非综合征型唇腭裂患者371例为病例组，其中汉族患者

166例，回族患者205例；收集患者父亲196例，患者母亲224例，其中150例患者为NSCL/P核心家系；258例健康新生儿为对照组，其中汉族190例，回族68例。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测Wnt3基因多态位点rs142167和rs7216231基因型，对比分析2组的基因型和等位基因，并进行传递不平衡检验（TDT）和以家系为基础的相关性检验（FBAT）分析。结果 回汉族人群病例组与对照组比较及其民族分层比较，唇裂、腭裂、唇腭裂及总病例组rs142167和rs7216231位点均无统计学差异（P>0.05）。TDT分析结果显示：rs142167和rs7216231位点的等位基因均不存在过传递（P>0.05）。FBAT分析结果显示：单倍型G-G具有统计学意义（P<0.05）。结论 Wnt3基因多态性与宁夏地区回汉族人群非综合征型唇腭裂不存在相关性。

[关键词] 非综合征型唇腭裂； Wnt3； 单核苷酸多态性

[中图分类号] R 782.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.017

非综合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with

or without cleft palate，NSCL/P）的病因较为复杂，

涉及环境与遗传因素及其交互作用[1]。目前已有多

个可能相关的候选基因及环境因素，但不同地区甚至不同表型NSCL/P的候选基因有很大差异，研究结果重复性差[2-3]。Wnt家族参与生物体内广泛的生物学效应，影响着生物体的生长发育。2008年Chiquet等[4]报道了Wnt家族的Wnt3基因多态性与NSCL/P有相关性。2010年Menezes等[5]也发现Wnt3基因多态性与

NSCL/P有显著相关性。目前，Wnt3基因多态性与NSCL/P的相关性尚未得到广泛的支持及验证，国内也无关于Wnt3基因与NSCL/P相关性的研究报道。本研究选择人口流动性不大、遗传较为稳定的宁夏地区人群为研究对象，以揭示中国宁夏地区回汉族人群中Wnt3基因单核苷酸多态性（single nucleotide po-

lymorphism，SNP）与NSCL/P是否存在相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集宁夏地区回汉族人群的SNP患者371例为病例组，其中汉族患者166例，回族患者205例，要求患者家庭至少三代为宁夏籍贯，并且排除其他先天性畸形及综合征型唇腭裂。收集患者父亲196例，患者母亲224例，其中150例患者为NSCL/P核心家系。

收集同期在宁夏医科大学总医院出生的258例健康新生儿为对照组，其中汉族190例，回族68例，要求家庭至少三代为宁夏籍贯。

1.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polyme-

rase chain reaction-restriction fragment length

polymorphisms，PCR-RFLP）检测

采集外周血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，提取基因组DNA，进行PCR扩增。应用Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物和内切酶（表1）。PCR反应体系：待测DNA模板50～100 μg、MasterMix 12.5 μL。上下游引物各2 μmol·L-1，用去离子水补足为25 μL。反应条件：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，rs142167 60 ℃及rs7216231 52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环。PCR产物酶切：取PCR扩增产物5 μL，加Cf rⅠ限制性内切酶和NmuC Ⅰ1 U及相应的10×buffer 1 μL，37 ℃水浴酶切12～16 h。电泳分析酶切产物，取10 μL酶切产物上样，在3%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察结果，确定个体的基因型。随机挑选10%的标本进行直接测序。

1.3 统计分析

对患者及其父母和对照组的基因型分布进行Hardy-Weinberg（HW）平衡检验。采用PASW statis-tics 18软件对患者与对照组的基因型和等位基因进行分析，采用传递不平衡检验（transmission disequi-

librium test，TDT）以及以家系为基础的相关性检验

（family based association test，FBAT）分析Wnt3的

rs142167和rs7216231多态位点与NSCL/P的相关性，并进行2个位点间组合的单倍型分析。FBAT参数设定为基因型模型、双等位遗传模型。依据民族不同，将病例组与对照组人群又分为汉族和回族，进行rs142167、rs7216231基因型及等位基因的比较。

2 结果

2.1 基因分型

rs142167和rs7216231多态位点的酶切电泳分型结果见图1、2。酶切后分型的结果与测序的结果完全一致。

M：DNA marker；1、3、7：杂合子AG；2、4、5：纯合子GG；6：纯合子：AA。

2.2 HW平衡检验

HW平衡检验表明：患者及其父母和对照组的基因频率分布均符合HW平衡，且无统计学差异（P>0.05）。

2.3 2组的基因型和等位基因分析

rs142167位点和rs7216231位点基因型、等位基因频率在患者组及对照组的分布和比较见表2～4。与对照组相比较，唇裂、腭裂、唇腭裂以及总病例组的rs142167（P=0.33，P=0.51，P=0.61，P=0.50）和

rs7216231（P=0.35，P=0.15，P=0.29，P=0.25）位点均无统计学差异。与对照组汉族人比较，唇裂组、腭裂组、唇腭裂组及总病例组汉族人的rs142167（P=0.98，P=0.31，P=0.69，P=0.72）和rs7216231（P=1.10，P=0.24，P=0.62，P=0.75）位点均无统计学差异。

与对照组回族人比较，唇裂组、腭裂组、唇腭裂组及总病例组回族人的rs142167（P=0.25，P=0.99，P=0.76，P=0.89）和rs7216231（P=0.19，P=0.56，P=

0.63，P=0.45）位点均无统计学差异。

2.4 TDT分析

TDT分析结果（表5）显示：rs142167和rs7216231位点的等位基因均不存在过传递（P>0.05）。

2.5 FBAT分析

FBAT分析结果（表6）表明：单倍型G-G具有统计学意义（P<0.05），是NSCL/P的保护性单倍型，其他3种单倍型均无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

NSCL/P是一类多基因遗传病，病因较复杂，具有显著的遗传异质性，并且受环境因素影响。Wnt家族基因散在分布于各条染色体中，在进化中高度保守，编码一类富含半胱氨酸的分泌蛋白，在胚胎的原肠胚及中胚叶的形成过程中起重要的作用，调节肿瘤细胞和干细胞的增殖、分化和存活[6]，并涉

及组织器官生长发育的多个方面。Niemann等[7]在对tetra-amelic综合征的研究中发现，Wnt3基因的纯合无义突变可使患者的四肢阙如、泌尿生殖系统发育障碍并伴有唇裂。Chiquet等[4]2008年报道在人类唇

腭裂病例中发现了Wnt基因编码区及非编码区的多个突变与之相关，并报道了Wnt3在内的7个Wnt基因的38个单核苷酸多态性位点和NSCL/P相关性的研究。其研究结果显示：Wnt3与美国人群和西班牙人群NSCL/P具有显著相关性。Menezes等[5]在高加索人群中也发现Wnt3与NSCL/P有显著相关性。本文探讨了Wnt3的SNP多态位点与中国宁夏回汉族人群NSCL/P之间的相关性。

本研究病例组Wnt3的rs142167位点的A等位基因频率为34%，G等位基因频率为66%，与HapMap数据库中北京汉族人群A等位基因频率36%和G等位基因频率64%基本一致。Menezes等[5]报道rs142167

与非综合征型唇腭裂具有显著相关性。而本研究中rs142167在各组之间无统计学差异（P>0.05），提示

SNP rs142167与宁夏地区回汉族人群NSCL/P不相关。rs7216231位点的A等位基因频率为65%，G等位基因频率为35%，与HapMap数据库中北京汉族人群A等位基因频率64.8%和G等位基因频率35.2%也基本一致。同时本研究结果也提示rs7216231与宁夏地区回汉族人群NSCL/P不相关。这与其他学者[4-5]的研究结果不一致，这种差异的产生可能与遗传异质性及种族差异性有关。单倍型G-G（rs142167-rs7216231位

点组成的单倍型）具有统计学意义（P<0.05），G-G是NSCL/P的保护性单倍型（Z=-2.180），这一结果可能是

由于单个等位基因不是造成NSCL/P的因素或保护因素，但当两个等位基因叠加或者多个等位基因叠加就会增加NSCL/P的患病概率或者保护概率。

NSCL/P被公认为是一种由多个微效基因与环境因素共同作用所致的复杂疾病，具有明显的遗传异质性、表型复杂性及种族差异性。本实验结果在一定程度上反映了NSCL/P存在种族差异性及遗传异质性，但不能排除环境因素的影响，今后尚需进一步增加对Wnt3的其他SNP位点的研究，并纳入环境因素一起来探讨其对NSCL/P发病的影响。

[参考文献]

[1] Lidral AC， Murray JC. Genetic approaches to identify disease genes

for birth defects with cleft lip/palate as a model[J]. Birth Defects

Res A Clin Mol Teratol， 2004， 70（12）：893-901.

[2] Marazita ML， Field LL， Cooper ME， et al. Nonsyndromic cleft lip

with or without cleft palate in China： Assessment of candidate

regions[J]. Cleft Palate Craniofac J， 2002， 39（2）：149-156.

[3] Marazita ML， Field LL， Cooper ME， et al. Genome scan for loci

involved in cleft lip with or without cleft palate， in Chinese mul-

tiplex families[J]. Am J Hum Genet， 2002， 71（2）：349-364.

[4] Chiquet BT， Blanton SH， Burt A， et al. Variation in WNT genes

is associated with non-syndromic cleft lip with or without cleft

palate[J]. Hum Mol Genet， 2008， 17（14）：2212-2218.

[5] Menezes R， Letra A， Kim AH， et al. Studies with Wnt genes and

nonsyndromic cleft lip and palate[J]. Birth Defects Res A Clin Mol

Teratol， 2010， 88（11）：995-1000.

[6] Jiang R， Bush JO， Lidral AC. Development of the upper lip： Mor-

phogenetic and molecular mechanisms[J]. Dev Dyn， 2006， 235（5）：

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[7] Niemann S， Zhao C， Pascu F， et al. Homozygous WNT3 mutation

causes tetra-amelia in a large consanguineous family[J]. Am J Hum

Genet， 2004， 74（3）：558-563.

（本文编辑 李彩）