丹皮酚对人乳腺导管癌细胞MDA－MB－435增殖的影响

王建杰 罗文哲 苗 智 闫冬梅 王茉琳 (佳木斯大学基础医学院免疫教研室，黑龙江 佳木斯 154007)

丹皮酚是牡丹皮中的主要活性成分〔1〕，能抑制某些肿瘤细胞的增殖，如人白血病细胞株K562，人肝癌细胞株Bel-7404，人宫颈癌细胞株 HeLa以及人大肠癌细胞株HT-29〔2～4〕。并能够增强化疗药物顺铂抗食管癌的作用〔5〕。本课题组应用丹皮酚处理EMT6(小鼠乳腺浸润性导管癌)小鼠实体瘤，证明了丹皮酚能很好地抑制肿瘤生长，并揭示其抗肿瘤机制是诱导了肿瘤细胞凋亡〔6〕。但小鼠与人之间存在着种属特异性，因此本文选取体外培养的人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435作为研究对象，进一步观察丹皮酚对人MDA-MB-435细胞生长的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人乳腺癌细胞株MDA-MB-435购于中国医学科学院肿瘤研究所细胞库。

1.1.2 试剂药品 丹皮酚来自沈阳药科大学提纯分离，纯度＞98%。RPMI1640培养液购于Gibco公司，胎牛血清来源于Hyclone公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、苏木精、伊红为北京拜尔迪生物技术公司产品。二甲基亚砜(DMSO)为Sigma Aldrich Inc公司产品。流式细胞仪，Epics-XLⅡ型，美国Becton Dickinson公司;荧光显微镜及照相系统为德国莱卡公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人MDA-MB-435细胞以适量浓度接种于9 cm细胞培养皿中。加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长，每2～3天传代1次。实验均于细胞处于对数生长期时进行。

1.2.2 MTT法检测丹皮酚对MDA-MB-435细胞增殖活性的影响 对数生长期的肿瘤细胞以0.25%胰酶消化，调整细胞密度至 5 ×104～1 ×105/ml，并接种于 96 孔培养板中，每孔 100 μl，培养 24 h，加入不同浓度(7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 mg/L)的丹皮酚，每个浓度均设4个平行孔，用RPMI1640完全培养液作为阴性对照组，同时设空白调零，放于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24、48 h后，每孔加入5 mg/ml的 MTT 20 μl，于培养箱中继续培养 4 h 后，加入 200 μl DMSO 溶液，振荡10 min后于酶标仪492 nm处测OD值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1－实验组OD值/对照组OD值)×100。

1.2.3 苏木素-伊红(HE)染色检测丹皮酚对MDA-MB-435细胞形态的影响 处于对数生长期的细胞用胰酶消化，RPMI1640完全培养液配成单细胞悬液，浓度为5×105个/ml。将细胞爬片置于6孔培养板内，每孔加入2 ml细胞悬液，24 h后磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，加入60 mg/L的丹皮酚，阴性对照组加2 ml RPMI1640完全培养液，放于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24、48 h后，吸尽培养液，取出细胞爬片，置于4%多聚甲醛固定液中，4℃过夜。常规HE染色。梯度酒精脱水，树胶封片，光镜下观察拍照。

1.2.4 流式细胞仪检测MDA-MB-435细胞周期 将对数生长期细胞均匀接种于6孔板，60 mg/L药物处理24、48 h。胰酶消化液进行消化，收集细胞于1.5 ml离心管中。1 500 r/min离心5 min，用75%酒精细胞重悬，洗涤细胞1次。再加入1 ml乙醇固定细胞，流式细胞仪进行细胞周期检测，结果以CellQuest软件分析。

1.3 统计学分析 采用t检验。

2 结果

2.1 丹皮酚对细胞增殖活性的影响 丹皮酚处理MDA-MB-435细胞 24 h的 IC50高于 250 mg/L，而 48 h后的 IC50约为60 mg/L，说明丹皮酚作用48 h后对MDA-MB-435细胞增殖具有直接抑制作用，并呈剂量依赖性。

2.2 丹皮酚处理后MDA-MB-435细胞形态学 细胞爬片经HE染色，光镜下可见对照组的MDA-MB-435细胞生长良好，细胞呈多边形，胞浆多，胞核染色质疏松，染色较淡。而丹皮酚处理MDA-MB-435细胞24、48 h后，细胞生长受到不同程度的抑制，出现细胞胞体变圆，体积缩小，胞浆起泡，部分细胞浮起，胞膜皱缩染色质凝集，核深染等形态变化。见图1。

2.3 细胞周期分析 60 mg/ml丹皮酚处理24 h和48 h后，MDA-MB-435细胞在G0/G1期的百分数增加，而S期和G2/M细胞数减少，说明丹皮酚阻滞细胞周期从G1到S期的转化。此外，在丹皮酚处理24、48 h后，均出现了Sub-G1期，与对照组比较差异显著(P＜0.01)。见图2。

图1 丹皮酚(60 mg/L)对MDA-MB-435细胞形态学的影响(HE，×200)

图2 丹皮酚(60 mg/L)处理后MDA-MB-435细胞周期结果

3 讨论

本结果显示丹皮酚能够明显抑制MDA-MB-435细胞增殖。肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性生长，而失控性增殖的根本原因就是细胞周期调控机制的破坏。肿瘤细胞增殖快慢主要取决于细胞G0/G1期的长短。G0/G1期短，肿瘤细胞增殖快，处于G0/G1期的细胞数少〔7〕。文献报道，当细胞生长阻滞在G1期达到一定程度和时间后，仍不能解除阻滞将会使细胞无法进入S期，则激活细胞内的某种机制，启动程序性细胞死亡，从而引发凋亡〔8〕。本文中阻滞于细胞周期从G1到S期，表明丹皮酚影响肿瘤细胞内DNA的复制和合成，抑制细胞的正常分裂，从而抑制肿瘤细胞的增殖，进而导致肿瘤细胞凋亡。凋亡细胞的DNA在内源性核酸内切酶的作用下裂解成180～200 bp或与之成整数倍的寡核苷酸片段，经过染色后显示DNA峰值时，会在正常二倍体DNA峰(G1)之前出现一个亚二倍体峰(Sub-G1峰)，即凋亡峰。本实验丹皮酚处理24、48 h后，即出现了凋亡峰。可见丹皮酚阻滞细胞周期在G0/G1期，并诱导了肿瘤细胞凋亡，由此说明丹皮酚发挥抗癌作用的重要机制之一可能是影响了细胞周期和诱导乳腺癌细胞凋亡。

1 孙国平，沈玉先，张玲玲，等.丹皮酚的体内外抗肿瘤作用〔J〕.安徽医科大学学报，2002;37(3):183-5.

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3 刘长青，谭诗云，计春燕，等.丹皮酚对大肠癌HT-29细胞的增殖抑制作用及其机制的探讨〔J〕.中国药理学通报，2005;21(10):1251-4.

4 Sun GP，Wang H，Xu SP，et al.Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production〔J〕.Eur J Pharmcol，2008;584(2-3):246-52.

5 Borner C.The Bcl-2 protein family:sensors and checkpoints for life-ordeath decisions〔J〕.Mol Immunol，2003;39(11):615-47.

6 Mimura K，Baba S.Determination of paeonol metabolites in man by the use of stable isotopes〔J〕.Chem Pharm Bull，1981;29(7):2043-50.

7 Wang JJ，Li QW，Ou YT，et al.Antitumor effects of paeonol on mice bearing EMT6 breast infiltrating ductal carcinoma〔J〕.Lat Am J Pharm，2010;29(3):369-89.

8 Evan GI，Vousden KH.Proliferation，cell cycle and apoptosis in cancer〔J〕.Nature，2001;411(6835):342-8.