内皮祖细胞磁性标记及MR示踪在大鼠脑胶质瘤血管生成研究中的应用

陈伟志 (辽宁医学院附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

胶质瘤是中枢神经系统常见肿瘤之一，生长速度快且复发性强〔1〕。肿瘤的生长和侵袭依赖于肿瘤的血管生长，而血管内皮祖细胞可参与肿瘤血管的新生〔2〕。因此，近年来对于内皮祖细胞参与肿瘤血管新生的过程有大量的研究。活体示踪细胞是分子影像学的重要方法之一，能有效动态观察机体的内部变化〔3〕。有研究使用超微超顺磁性氧化铁(USPIO)对干细胞进行标记并通过磁共振成像(MR)示踪〔4〕，而内皮祖细胞磁性标记及MR示踪并无相关报道。本研究采用USPIO进行大鼠脑胶质瘤血管生成过程中的内皮祖细胞磁性标记及MR示踪。

1 材料与方法

1.1 实验对象 提取细胞动物选取雄性SPF级SD大鼠4只，体重(100±10)g;观察动物选取雄性SPF级SD大鼠16只，体重(300±50)g;胶质瘤细胞株选取C6胶质瘤细胞株系。

1.2 方法

1.2.1 骨髓来源的内皮祖细胞分离 首先将体重(100±10)g SD大鼠处死，提取骨髓来源的单核细胞，EGM-2培养基进行培养，条件为37℃，5%CO2浓度，培养14 d左右进行传代，所得即为骨髓来源的内皮祖细胞。

1.2.2 USPIO-QDs双标记 将25 μg/ml的磁性标记 USPIO与0.5 μg/ml的多聚赖氨酸混合，并与EGM-2培养基混匀，37℃下孵育24 h。将已磁性标记和未磁性标记的内皮祖细胞，加入2%亚铁氰化钾与6%盐酸，进行Prussian blue染色，以观察对内皮祖细胞的标记率。USPIO标记后，使用Qtracker565 cell labeling试剂盒对其进行量子点(QDs)荧光标记。将1 μl PBS缓冲液和波长为565 nm的QDs与0.2 ml EGM-2培养基混合，共同孵育24 h后，加入 Qtracker565 cell labeling培养液，37℃下孵育1 h。PBS清洗5次后，进行Prussian blue染色，并在光镜下观察。

1.2.3 脑胶质瘤模型的建立 使用脑立体定位仪对SD大鼠进行右侧基底节区定位微注射，于冠状缝前1 mm、中线右旁开3 mm、深 5 mm 注射 C6 胶质瘤细胞悬液 10 μl，速度 1 μl/min。

1.2.4 USPIO-QDs双标记内皮祖细胞的移植 胶质瘤细胞注射大鼠5 d后，使用磁共振进行扫描并观察瘤体生长情况，2 d后进行内皮祖细胞移植。将16只SD大鼠随机分为2组，每组8只，实验组通过尾静脉注射USPIO-QDs内皮祖细胞悬液1 ml，对照组通过尾静脉注射未标记的内皮祖细胞悬液1 ml。

1.2.5 MR示踪脑胶质瘤内USPIO-QDs内皮祖细胞 分别于移植内皮祖细胞前2 d及移植后1、2、4 d后进行3.0 T MR扫描，主要包括 T1WI、T2WI、T2*map 扫描;T1WI扫描 TR=400 ms、TE=9.5 ms，T2WI 扫描 TR=2 000 ms、TE=46 ms，T2*map扫描 TR=120 ms、TE=2.8 ～35.4 ms。

1.2.6 大鼠脑组织切片荧光显微镜观察 将USPIO-QDs双标记移植细胞2、4 d后的大鼠鼠尾静脉注射1 mg/ml德克萨斯红标记的番茄凝集素0.5 ml，处死大鼠并进行脑组织冰冻切片，荧光显微镜下观察肿瘤的新生血管生成。

2 结果

2.1 内皮祖细胞的USPIO-QDs标记 分别对USPIO磁性标记和未标记的内皮祖细胞进行Prussian blue染色，发现磁性标记的细胞胞浆内显示蓝色，而未标记细胞则无蓝色显示。使用波长为565 nm的QDs与内皮祖细胞进行孵育，随后在荧光显微镜下进行观察，发现内皮祖细胞显示绿色荧光，发光位置在胞浆内部，说明USPIO-QDs可以对内皮祖细胞进行双标记。见图1。

图1 内皮祖细胞的USPIO-QDs标记

图2 MR示踪对照组大鼠未磁性标记内皮祖细胞

2.2 MR示踪磁性标记内皮祖细胞 在脑胶质瘤细胞接种7 d后，向实验组和对照组的大鼠移植磁性标记和未标记的内皮祖细胞，分别对其进行MR扫描。由图2可见，对照组大鼠右侧基底节区显示等T1长T2的信号，可见瘤体的强化，T2*map序列下肿瘤区见线状针道信号，肿瘤组织在T2*map序列未见明显异常的信号。

图3显示，实验组大鼠磁性标记的内皮祖细胞移植前2 d，T1WI没有显示出明显的异常信号，T2*map可见稍低信号，可能为针道信号;移植24 h后，T1WI右侧基底节区呈现稍高的信号，T2WI和T2*map扫描下发现瘤周间断线状低信号;48 h及4 d后的磁共振扫描均可见瘤周的低信号存在，但低信号有消散的趋势，说明内皮祖细胞迁移至肿瘤后开始增殖和分化。此结果显示，磁性标记的内皮祖细胞向瘤体迁移的过程可以被MR所示踪。

2.3 内皮祖细胞迁移显示肿瘤新生血管生成 将注射德克萨斯红标记的番茄凝集素后死亡的大鼠进行脑组织冰冻切片，荧光显微镜观察发现内皮祖细胞迁移到肿瘤组织，并且分布在肿瘤的边缘，显示绿色荧光;红色荧光显示番茄凝集素标记的肿瘤新生血管。对图片进行merge发现两种荧光存在共定位，说明内皮祖细胞迁移至肿瘤后参与了新生血管的生成。Prussian blue染色显示，QDs绿色荧光与Prussian blue阳性细胞处在同样位置，说明此为USPIO-QDs双标记的内皮祖细胞，进一步验证了内皮祖细胞参与新生血管生成的可能性。见图4。

图3 MR示踪实验组大鼠磁性标记内皮祖细胞

图4 内皮祖细胞迁移显示肿瘤的新生血管生成

3 讨论

研究发现，骨髓内部的内皮祖细胞可以分化为血管的内皮细胞〔5〕，在成体的血管新生中起重要的作用，成为近年来研究的热点，不仅为血管新生的机制研究提供了新途径，并为血管损伤、恶性肿瘤等的临床治疗提供了新思路和方法〔6〕。而血管生成在机体生理和病理过程中都起着重要作用〔7〕，研究发现肿瘤的生长和侵袭等都依赖于血管的生成，而内皮祖细胞则在肿瘤分泌产生的细胞因子作用下运动到外周血，参与肿瘤血管的生成〔8〕。因此，如何观察内皮祖细胞参与肿瘤血管形成的过程是抑制肿瘤生长、侵袭的前提之一〔9〕。

随着分子影像学的快速发展，活体观察组织的变化成为目前研究的热点，通过标记细胞进行MR示踪对于观察机体的代谢和变化有其独特的优越性。目前标记干细胞的MR对比剂主要分为两种:(1)顺磁性对比剂，如常见的Gd螯合剂，通过产生T1正性对比效应对细胞进行标记;(2)单/多晶体氧化铁为基础的对比剂，较强的T2负性对比效应标记细胞，其优点在于穿透力较强，低浓度即可形成磁共振的对比〔10〕。USPIO即为其中常用的对比剂之一，能够产生较大的顺磁性，在自旋回波和梯度回波序列时形成低信号区而成像〔11〕。本研究说明磁性标记的内皮祖细胞向瘤体迁移的过程可以被MR所示踪。

通过鼠尾静脉注射德克萨斯红标记的番茄凝集素，可确认双标记的内皮祖细胞向瘤体迁移，并且分布在肿瘤的边缘，而荧光共定位也显示双标记的内皮祖细胞参与了肿瘤血管的生成，因此，MR示踪展示了内皮祖细胞从移植到参与肿瘤血管生成的中间过程，并有可能继续观察后续的进程。

综上所述，USPIO对于内皮祖细胞磁性标记和MR示踪是一种有效的标记物，而MR也是活体示踪观察USPIO标记的脑胶质瘤血管生成的有效手段。随着MR发展速度的加快和更多示踪剂的研发，无创、动态观察越来越受到重视。在临床观察与基础研究中，USPIO磁性标记和MR示踪会得到越来越广泛的应用。

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3 Algar WR，Susumu K，Delehanty JB，et al.Semiconductor quantum dots in bioanalysis:crossing the valley of death〔J〕.Anal Chem，2011;83(23):8826-37.

4 Vreys R，Soenen SJ，De Cuyper M，et al.Background migration of USPIO/MLs is a major drawback for in situ labeling of endogenous neural progenitor cells〔J〕.Contrast Media Mol Imaging，2011;6(1):1-6.

5 麦筱莉，滕皋军，马占龙，等.外周血内皮祖细胞磁探针标记及体外磁共振成像的实验研究〔J〕.中华心血管病杂志，2007;35(9):838-43.

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11 贾振宇，陈 骏，滕皋军，等.小鼠脾源性内皮祖细胞培养及7.0T磁共振单细胞成像初探〔J〕.中华心血管病杂志，2010;38(2):166-70.