卡托普利预处理对急性心肌损伤大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

周 艳 王 瑾 白 洋 鞠文博 顾 明 (北华大学基础医学院组胚教研室，吉林 吉林 0)

研究表明，在心肌细胞缺血缺氧导致心肌损伤的病理过程中，细胞凋亡参与了此过程〔1〕。因此，如何干预细胞凋亡成为研究热点。卡托普利是一种血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，用于高血压的药物治疗已取得了良好效果。本实验通过建立大鼠急性心肌损伤模型，部分模型给予卡托普利预处理，探讨ACEI对心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 卡托普利粉剂由常州制药厂提供;Iso由美国Sigma公司提供;细胞凋亡检测试剂盒由美国Roche公司提供;Fas兔多克隆抗体、FasL兔多克隆抗体、Bcl-2兔多克隆抗体及Bax兔多克隆抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 实验动物分组 60只健康的雄性Wistar大鼠，体重(180±15)g(由北华大学实验动物中心提供)，普通饲料和水适应性喂养1 w后，按体重随机分为3组，每组20只。Iso损伤组:腹腔内注射 Iso 5.0 mg·kg－1·d－1，连续 2 d;对照组:腹腔内注射生理盐水5.0 mg·kg－1·d－1，连续2 d;Cap预处理组:腹腔内注射 Iso 5.0 mg·kg－1·d－1，连续 2 d。Cap 预处理组注射前1 d给予卡托普利100mg·kg－1·d－1灌胃，连续3 d;Iso损伤组和对照组均在注射前1d给予生理盐水3ml灌胃，连续3 d。末次注药后24 h，拉颈处死大鼠，按实验要求取材。

1.3 观测指标及实验方法

1.3.1 TUNEL方法检测心肌细胞凋亡 开胸取大鼠心脏后，沿右室游离壁正中心脏长轴切开，取1/2心脏用4%多聚甲醛常温下固定24 h，常规石蜡包埋，并制成5 μm厚切片，用于检测细胞凋亡，操作步骤按试剂盒说明进行，光学显微镜下观察。

1.3.2 免疫组化方法检测Fas、FasL、Bcl-2和Bax蛋白表达 取石蜡切片标本进行免疫组化及DAB显色，操作步骤按试剂盒说明进行，光学显微镜下观察，细胞质中出现棕黄色染色为阳性。

2 结果

2.1 心肌细胞凋亡检测 正常的心肌细胞核被染成蓝色，凋亡的心肌细胞核被染成棕褐色。根据显色浓淡和颗粒多少将染色强度分为－～。凡达到阳性者都认为是凋亡细胞。本实验显示，对照组大鼠心肌组织内仅偶见凋亡细胞;Iso损伤组和Cap预处理组大鼠心肌组织内均可见到大量的凋亡细胞，但Cap预处理组与Iso损伤组比较，心肌细胞凋亡指数明显减少，两组间有显著差异(P＜0.01)。见表1和图1。

表1 大鼠心肌凋亡指数、凋亡相关基因的表达(±s)

表1 大鼠心肌凋亡指数、凋亡相关基因的表达(±s)

与Iso损伤组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05;与对照组比较:3)P＜0.01

组别 n 凋亡指数(%)Fas蛋白表达指数(%)FasL蛋白表达指数(%)Bcl-2蛋白表达指数(%)Bax蛋白表达指数(%)对照组20 0.99±0.39 2.94±0.60 0 5.60±0.78 6.08±0.78 Iso损伤组 30 12.72±2.943) 17.17±2.223) 8.50±1.44 4.52±0.473) 11.27±1.023)Cap预处理组 20 6.13±1.151) 12.96±1.411) 6.40±0.641) 5.34±0.791) 10.58±1.032)

2.2 免疫组化方法检测Fas、FasL、Bcl-2和Bax蛋白表达 图2～图5可见，Fas、FasL、Bcl-2和Bax蛋白免疫组化阳性反应均为呈现黄或棕黄色颗粒，在胞质中表达，三组中各个蛋白的表达强度不一，与心肌细胞凋亡发生部位基本一致。表1显示:对照组Fas、Bax蛋白表达水平较低，Bcl-2有一定程度表达，未见FasL蛋白阳性表达;Iso损伤组与对照组比较，Fas、FasL和Bax蛋白表达增加，Bcl-2表达降低，组间有显著性差异(P＜0.01);Cap预处理组与Iso损伤组比较，Fas、FasL和Bax蛋白表达水平明显降低，Bcl-2表达增高、组间有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)。

图1 各组心肌细胞凋亡情况(×66)

图2 各组心肌细胞Fas蛋白表达(×66)

图3 各组心肌细胞FasL蛋白表达(×66)

图4 各组心肌细胞Bcl-2蛋白表达(×66)

图5 各组心肌细胞Bax蛋白表达(×66)

3 讨论

本实验用异丙基肾上腺素成功制造出缺血性心肌损伤的动物模型，其病理特点、电生理、心肌酶学等变化与缺血性心脏病都很类似。细胞凋亡的发生受一系列基因调控，目前已知的促凋亡基因有 Fas、Bax、ICE、ICH-1、iNOS 及 wp53 基因，抗凋亡基因有Bcl-2、Bcr/Abl、CrmA、ras及mp53基因等。在心肌梗死时远离梗死区的正常心肌细胞很少发生细胞凋亡;在缺血区和正常区的分界处有凋亡细胞的存在，而在心肌坏死的中心区域混有大量的凋亡细胞，这说明也许心肌细胞的死亡是以细胞凋亡开始的，凋亡细胞增加，直到造成细胞坏死〔2〕。本研究表明，Iso损伤组与对照组比较，心肌细胞凋亡指数明显增加;Fas、FasL和Bax蛋白的表达明显增加，Bcl-2表达明显减少，表明Fas、FasL、Bax和Bcl-2基因参与了异丙基肾上腺素致大鼠心肌损伤过程中心肌细胞凋亡进程的调控。Fas基因的表达，主要是通过Fas-FasL-FADD-Caspase-8-Caspase-3的凋亡信号转导级联系统，经Caspase-8途径链式激活，最终导致细胞凋亡，这条通路称为细胞凋亡的外通路。线粒体是维持细胞正常功能的重要细胞器，线粒体内含有的细胞色素C则是参与氧化磷酸化的重要成分。心肌细胞是体内线粒体含量最丰富的细胞，缺血可促进线粒体释放细胞色素C，细胞色素C首先与凋亡活化因子-1(Apaf-1)结合，激活Caspase-9，并最终激活Caspase-3，引起细胞凋亡，这条通路称为细胞凋亡的内通路。线粒体释放细胞色素C的过程主要受Bcl-2家族的调控，其中Bcl-2和Bax在线粒体表面分别发挥相反的作用。Bcl-2可抑制线粒体膜通透性转变孔的开放，减少细胞色素C的释放，并促使氢离子从线粒体中泵出，并提高线粒体的钙缓冲能力，阻止Caspase-9凋亡激活途径，抑制细胞凋亡。而Bax可促进线粒体膜通透性转变孔的开放，增加细胞色素C的释放从而拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。

与Iso损伤组比较，Cap预处理组Fas、FasL、Bax蛋白的表达减少，Bcl-2蛋白的表达增加，提示卡托普利在心肌组织损伤过程中参与了细胞凋亡相关基因的的调控。有研究发现，卡托普利预处理可诱导hsp70的合成。hsp70是细胞保护性蛋白，能促进新生多肽链的正确折叠，协助新生蛋白质的合成和修复损伤的蛋白质，维持蛋白质合理构象;并能激活某些酶的作用，以维护细胞的功能和生存〔3～5〕。Klein 等〔6〕用 hsp70 基因转染RAW 264.7鼠巨噬细胞，发现hsp70过度表达的细胞中细胞色素C胞浆转位以及Caspase-9和caspase-3的活化明显降低，认为hsp70干扰了细胞色素C从线粒体的释放，这可能是hsp70抑制细胞凋亡的机制之一;另外，缺血性心肌损伤可导致Bcl-2蛋白的变性，hsp70可通过对变性的Bcl-2蛋白进行修复及防止其降解，来恢复其凋亡抑制功能。Gordon等〔7〕发现上调hsp70表达能明显减少Bax蛋白的表达，Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是决定促进或抑制细胞凋亡强度的关键因素。王万银等〔8〕的研究认为，hsp 70可能通过抑制caspase-8和caspase-3的活力来降低Fas通路的活化，减轻心肌细胞凋亡。本研究表明，卡托普利预处理可通过减少心肌细胞凋亡及降低凋亡相关基因的表达有关，来发挥心肌保护作用。

1 Krijnen PA，Nijmeijer R，Meijer CJ，et al.Apoptosis in myocardial ischemia and infarction〔J〕.J Clin Pathol，2002;55(11):801-11.

2 Itho G，Tamura J，Suzuki M，et al.DNA fragmentation of human infarcted myocardial cells demonstrated by the nick end labeling method and DNA agarose gel electrophoresis〔J〕.Am J Pathol，1995;146(6):1325-31.

3 López N，Díez J，Fortuo MA.Characterization of the protective effects of cardiotrophin-1 against non-ischemic death stimuli in adult cardiomyocytes〔J〕.Cytokine，2005;30(5):282-92.

4 陈 辉，陆 超，周国平，等.心肌营养素-1在窒息新生大鼠心肌和外周血血浆中的表达及神经调节蛋白-1的干预作用〔J〕.实用儿科临床杂志，2008;23(14):1065-7.

5 顾 明，白 冰，张 旭，等.大鼠急性心肌损伤与CT-1 mRNA相关性的实验观察〔J〕.中国地方病学杂志，2006;25(1):22-4.

6 Klein SD，Brune B.Heat-shock protein 70 attenuates nitric oxide-induced apoptosis in RAW macrophages by preventing cytochrome c release〔J〕.Biochem J，2002;362(6):635-41.

7 Gordon SA，Hoffman RA，Simmons RL，et al.Induction of heat shock protein 70 protects thromocytes against radiation-induced apoptosis〔J〕.Arch Surg，1997;132(12):1277-82.

8 王万银，弓景波，吴淑庆，等.预热诱导心肌细胞表达Hsp70对Fas通路活化后细胞凋亡变化的研究〔J〕.中国应用生理学杂志，2005;21(3):309-14.