桦褐孔菌醇对人胃癌BGC－823细胞周期的影响及其机制

崔 涛 钟秀宏 孙艳美 赵丽微 杨淑艳 关晓辉

(北华大学附属医院消化内科，吉林 吉林 132011)

桦褐孔菌提取物桦褐孔菌醇(Inotodiol)对多种人类肿瘤均有较强的抗肿瘤作用〔1，2〕。本研究前期通过MTT细胞活性分析Inotodiol对人胃癌BGC-823细胞有较显著的抑制作用，经流式细胞仪检测可呈剂量依赖性阻滞细胞于 S期〔3，4〕。基因突变、失活以及过度表达或表达降低等可引起肿瘤细胞周期变化，而药物如果作用过的肿瘤细胞在一定时间内无法克服细胞周期阻滞时就会发生凋亡。因此，本实验通过形态学观察Inotodiol对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响，然后通过免疫细胞化学染色检测CyclinA、增殖细胞核抗原(PCNA)和p21细胞周期蛋白表达，以进一步探索Inotodiol对BGC-823细胞产生S期阻滞的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞株BGC-823购自中科院上海细胞所。Inotodiol由河南大学药学院赵芬琴博士提取并鉴定。胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI1640和0.25%胰酶(Gibco，美国);CyclinA、p21 抗体、PCNA(Santa Cruz，美国)。

1.2 细胞培养与药物处理 胃癌BGC-823细胞株生长于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，另加青霉素100 U/ml、链霉素100 g/ml，置于37℃、5%CO2及饱和湿度为95%的培养箱中培养。待胃癌BGC-823细胞生长旺盛，取对数生长期细胞接种细胞于6孔板或25 cm2培养瓶中，待细胞长到80% ～90%融合度时，吸尽培养液，实验组加入无血清RPMI1640培养基配制的不同浓度(20、40、80 g/ml)Inotodiol，对照组加入等量不含Inotodiol的无血清 RPMI1640培养基，共同培养48 h，备用。

1.3 光学显微镜检测细胞凋亡 细胞爬片，经Inotodiol 80 g/ml作用48 h后，HE染色常规检测。

1.4 荧光显微镜检测细胞凋亡 细胞爬片，经Inotodiol 80 g/ml作用48 h后，加吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合液滴于盖玻片上(避光)，在Olympus荧光显微镜下观察，活细胞(VN)核染色质绿色，呈正常细胞结构。早期凋亡细胞(VA)核染色质绿色，呈固缩状。晚期凋亡细胞(NVA)核染色质橘红色，呈固缩状或破裂状。坏死细胞(NVN)核染色质橘红色，呈正常细胞结构。随机选择3个不同高倍视野(×400)，细胞凋亡率(%)=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。

1.5 免疫细胞化学染色法检测 CyclinA、p21、PCNA蛋白的表达 终浓度为80 g/ml的Inotodiol作用于胃癌BGC-823细胞48 h后，在4℃条件下用冷丙酮固定10 min，按试剂说明进行SP法免疫细胞化学染色。判定标准:以细胞核、细胞质呈清晰棕黄色为阳性细胞。随机选取10个高倍视野，分别计数阳性细胞百分比。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 Inotodiol诱导BGC-823细胞发生凋亡的形态学变化 HE染色光镜观察，对照组肿瘤细胞生长旺盛，呈不规则形，细胞核染色均匀，核仁清晰可见，核分裂像多见。实验组肿瘤细胞体积缩小，呈圆形或不规则形，胞质浓缩，核染色质浓缩，有的细胞膜起泡形成凋亡小体(图1)。AO/EB荧光染色荧光显微镜下观察，对照组肿瘤细胞大小形状较单一，核染色质呈绿色或黄绿色均匀荧光，胞质呈橘红色荧光。实验组BGC-823胃癌细胞表现为细胞体积变小呈圆形，细胞周围可见亮绿色或黄绿色荧光的圆形凋亡小体，胞核染色质呈绿色或橘红色，胞质内的橘红色或橘黄色荧光减弱或消失。坏死细胞核染色质呈橘红色，胞质膨胀或破裂(图2)。80 g/ml桦褐孔菌醇作用BGC-823胃癌细胞48 h，凋亡率为25%(见表1)。

2.2 Inotodiol对BGC-823细胞 CyclinA、PCNA、p21表达的影响 80 g/ml Inotodiol作用于BGC-823细胞48 h后，与对照组相比，细胞周期相关蛋白CyclinA、PCNA蛋白的表达减少和p21蛋白表达增加(P＜0.01，见图3，表2)。

表1 两组BGC-823细胞凋亡情况比较(n)

图1 HE染色光学显微镜观察BGC-823细胞凋亡(×400)

表2 两组BGC-823细胞CyclinA、PCNA和p21表达比较(n=10，±s)

表2 两组BGC-823细胞CyclinA、PCNA和p21表达比较(n=10，±s)

组别CyclinA PCNA p21对照组56.7±2.3 65.4.±2.7 19.2.±4.4实验组 26.9±2.91) 26.9±3.21) 45.2±4.71)

图2 AO/EB荧光染色荧光显微镜观察BGC-823细胞凋亡(×400)

图3 两组胃癌BGC-823细胞CyclinA、PCNA、p21表达(×400)

3 讨论

本研究发现，Inotodiol作用BGC-823细胞48 h后，除了对细胞增殖的影响外，在进行HE染色及AO/EB荧光染色中形态学观察发现，Inotodiol有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

肿瘤是一种周期性疾病，肿瘤细胞增殖抑制和细胞凋亡都与细胞周期受阻密切相关，三者之间存在复杂和精细的调控网络〔5〕。Yuki等〔6〕的研究表明，桦褐孔菌提取物可诱导 IMR90细胞阻滞于S期，并可引起细胞发生明显凋亡的变化，与κB受抑制有关;Youn等〔7〕报道，桦褐孔菌提取物使肝癌HEPG2细胞阻滞于 G0/G1期，并通过抑制 CyclinD1，CyclinD2，CyclinE，CDK2，CDK6抑制肿瘤细胞生长。

CyclinA是S期细胞周期蛋白，属于正向细胞周期调控蛋白，关键作用是促进DNA合成。PCNA是一种酸性核蛋白，它是DNA聚合酶δ的一个附属蛋白，它能在双链DNA周围形成一个滑动夹板，从而与DNA聚合酶δ相互作用，并使之持续合成DNA，PCNA在细胞周期的S期和G2期数量增高，因此，PCNA是DNA合成中的一个重要调节因子。而p21是细胞周期的负调控因子，能抑制PCNA的活性直接抑制DNA的合成〔8，9〕，高表达时可阻断正常细胞周期进程。Inotodiol可能通过减少CyclinA、PCNA细胞周期蛋白的生成和上调细胞周期负调控因子p21的表达，影响细胞周期，致使产生S期阻滞，进而实现其对人胃癌BGC-823细胞的抗癌效应。

1 Zhong XH，Wang LB，Sun DZ，et al.Effects of Inotodiol extracts from inonotus obliquus proliferation cycle and apoptotic gene of human lung ade-nocarcinoma cell line A549〔J〕.Chin J Integr，2011;17(3):218-23.

2 Zhong XH，Ren K，Lv SJ，et al.Progress of research on Inonotus obliquus〔J〕.Chin J Integr Med，2009;15:156-60.

3 崔 涛，钟秀宏，杨淑艳，等.桦褐孔菌的不同提取物对胃癌BGC-823细胞株的生长抑制作用的体外观察〔J〕.中国老年学杂志，2012;20(32):4442-3.

4 钟秀宏，杨淑艳，孙东植，等.桦褐孔菌提取物诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡的研究〔J〕.中国药房，2007;18(34):2661-3.

5 Subbareddy M，Sudharsana RA，Soumya P，et al.Cell survival，cell death and cell cycle pathways are interconnected:implications for cancer therapy〔J〕.Drug Resistance Updates，2007;10(1-2):13-29.

6 Yuki Nakajima，Hiroshi Nishida，Seiichi Matsugo，et al.Cancer cell cytotoxicity of extracts and small phenolic compounds from chaga Inonotus obliquus(persoon)Pilat〔J〕.J Med Food，2009;12(3):501-7.

7 Youn MJ，Kim JK，Park SY，et al.Chaga mushroom(Inonotus obliquus)induces G0/G1 arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells〔J〕.World J Gastroenterol，2008;14(4):511-7.

8 Levin DS，Bai W，Yao N，et al.An interaction between DNA ligaseⅠ and proliferating cell nuclear antigen:implications for okazaki fragment synthesis and joining〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94(24):12863.

9 Pan ZQ，Reardon JT，Li L，et al.Inhibition of nucleotide excision repair by the cyclin-dependent kinase inhibitor p21〔J〕.J Biol Chem，1995;270(37):220-8.