缺氧对食管鳞状细胞癌中缺氧诱导因子－1α和己糖激酶－Ⅱ表达的影响

朱智勇 马颖才 唐 莉 荣光宏 (青海省人民医院消化科，青海 西宁 810007)

研究表明，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)以及己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)在体内的高表达能够有效抑制肿瘤细胞的糖酵解，起到良好的抗癌作用〔1〕。本研究分析不同氧浓度对HIF-1α及HK-Ⅱ表达的影响，并观察HK-Ⅱ的表达与乳酸分泌之间的联系，探讨HIF-1α及HK-Ⅱ在肿瘤缺氧耐受机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人食管鳞状细胞癌细胞株TEl3和Ecal09，其中TEl3/shRNA细胞为 TEl3的HIF-1α稳定干扰株，Ecal09/shRNA细胞为Ecal09的HIF-1α稳定干扰株。逆转录酶试剂盒、细胞培养箱和缺氧培养箱、定量PCR仪、紫外分光光度仪以及乳酸浓度测定试剂盒、TRIzol、SYBR Green I RT-PCR Master Mix等。

1.2 方法

1.2.1 培养及分组 常规细胞培养。首先将细胞放置于胎牛血清的DMEM培养液内，待细胞生长至60%融合时取出，饥饿24 h。之后更换培养液，可以为无血清培养液。对细胞进行分组，观察组采用1%氧浓度，对照组采用20%氧浓度。观察两组细胞培养24、48 h后的HIF-1α及HK-Ⅱ表达情况。

1.2.2 实时定量PCR 利用TRIzo1提取总RNA，然后使用RT-PCR试剂盒进行逆转录，之后使用SYBR Green荧光染料进行实时定量 PCR扩增，反应条件为50℃ 5 min，95℃ 3 min，95℃ 20 s，60℃ 1 min，55个循环，每个循环结束后测定吸光度(A)值。随着PCR系统在每一个循环结束后测定A值，得到以循环数为横坐标、A值为纵坐标的定量曲线。

1.2.3 分光光度法测定乳酸浓度 取细胞培养上清液以分光光度法测定乳酸浓度。空白管加蒸馏水0.02 ml，标准管加3 mmol/L标准液0.02 ml，测定管加样本0.02 ml，各管中均加入酶工作液1 ml及显色剂0.2 ml，混匀后37℃水浴反应10 min，各管加终止液2 ml。混匀，530 nm，1 cm 光径，蒸馏水调零，分光光度仪测各管A值，根据空白管、标准管及测定管的A值计算得出细胞培养上清液的乳酸浓度(mmol/L)。……