离体脊髓同侧中央管周围区电刺激诱发运动神经元突触反应

秦 雯，郑 超，王邦安，汪萌芽

(皖南医学院 细胞电生理研究室，安徽 芜湖 241002)

脊髓运动神经元(motoneuron，MN)作为运动控制的“最后公路”，其活动依赖于多种通路的调控，包括外周传入、各种下行通路和脊髓内的神经元网络等［1－2］。已有研究表明，在新生大鼠脊髓切片MN，通过电刺激腹根［3］、同侧背根［4－5］、同侧［1，5－8］或对侧腹外侧索［9－10］均可在MN诱发突触反应，并观察到兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)、抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential，IPSP)以及EPSP复合 IPSP的反应类型，不过这些都是脊髓外输入通路的作用。脊髓内神经元网络对MN活动的调控，则以脊髓内的中枢模式发生器(central pattern generator，CPG)最为重要［11］，譬如近年有研究报道表明［12－14］，位于脊髓同侧中央管周围区(ipsilateral pericentral canal，iPCC)的胆碱能V0C中间神经元接受脊髓CPG等输入，并通过其神经末梢C型突触终扣(C bouton)直接与MN建立突触联系，对MN活动提供了主要的胆碱能调制。不过，iPCC至MN神经通路的突触传递类型和细胞电生理特性，目前尚不清楚。因此，本文应用新生大鼠脊髓切片MN细胞内记录技术，观察iPCC局部电刺激在MN诱发的突触反应，并分析兴奋性突触反应的基本电生理性质和可能的介导递质，为进一步研究MN活动的脊髓内调控、运动学习机制，以及可能的受体机制奠定基础。

1 材料与方法

1．1 实验动物及脊髓切片制备 取8～14 d龄新生SD大鼠15只(由南京江宁青龙山动物繁殖场提供)，雌雄不拘。按报道方法，经乙醚麻醉后分离出脊髓，用振荡切片机(Vibratome，Technical Products International Inc，USA)制备脊髓腰骶膨大部的横切片(400～500μm)厚片，置室温(25±3)℃下经95%O2和5%CO2混合气体饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中备用。

1．2 细胞内记录及电刺激 用吸管将脊髓切片移入自制的全浸式记录浴槽，用上下两个丝网相夹固定，持续灌流经混合气体饱和的处于室温(25±3)℃下的ACSF。取内充3 mol/L乙酸钾、尖端阻抗为80～140 MΩ的玻璃微电极，在显微镜下对脊髓腹角进行穿刺。记录到的电信号由Axoclamp-2B微电极放大器(Axon Instruments，USA)放大后，经DigiData 1200转换接口(Axon)输入计算机，用pClamp 7．0软件(Axon)进行采样、显示和贮存。细胞内电流注射由微机触发，经DigiData 1200联机接口到微电极放大器后，刺激电流由探头输出经微电极注入细胞内。脊髓同侧中央管周围区(iPCC)局部电刺激和腹根电刺激(图1)，由三通道电刺激器(日本光电)产生的方波脉冲，经隔离器以恒压模式至同芯双极刺激电极施加。

1．3 药物 Na+通道阻断剂河豚毒素(TTX，Sigma)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体阻断剂2-氨基-5-磷酸基戊酸(APV，Sigma)、γ-氨基丁酸A(GABAA)受体阻断剂荷包牡丹碱(bicuculline，Sigma)、甘氨酸受体阻断剂士的宁(strychnine，Sigma)，均用蒸馏水配成母液。非NMDA受体阻断剂 6，7-二硝基喹诺林-2，3-二酮(DNQX，Sigma)用二甲亚砜 (dimethyl sulfoxide，Sigma)溶解后，再用蒸馏水配成母液。临用前以ACSF将药物稀释到所需浓度灌流给药。低钙高镁溶液另外配置备用，即将ACSF配方中的Ca2+降至0．24 mmol/L，Mg2+升至 13 mmol/L，并降低 NaCl浓度以保持渗透压不变。

1．4 分析方法 实验记录到的资料，用 Clampfit 10．1 软 件 (Axon Instruments/Molecular Devices，USA)进行分析，数据统计分析用 Origin 5．0软件(Microcal Software Inc．，USA)，数据以(¯x±s)表示。

2 结果

选取静息电位(resting potential，RP)负于－60 mV且有超射的记录稳定、健康的细胞，通过加在脊髓腹根的同芯双极刺激电极进行逆行激活，若记录到具有全或无性质的动作电位(action potential，AP)，即可鉴定为MN。本实验对记录到的14个MN，进行记录分析，MN的基本电生理参数见表1。

图1 脊髓切片和记录方法VH:腹角;DH:背角;S1、S2分别表示腹根(VR)、同侧中央管周围区(iPCC)的刺激电极;R和A表示记录微电极和放大器Fig 1 Illustration of spinal cord preparation and its recording techniquesVH:Ventral horn;DH:Dorsal horn;S1，S2:Stimulating electrode on ventral root(VR)，ipsilateral pericentral canal(iPCC)，respectively;R and A:Intracellular recording microelectrode and its amplifier

表1 新生大鼠脊髓切片MN基本电生理参数(¯x±s，n=14)Tab 1 Electrophysiological parameters of motoneurons in neonatal rat spinal cord slices(¯x±s，n=14)

2．1 iPCC局部电刺激诱发的突触反应 实验中对记录到的14个MN，进行iPCC的局部恒压电刺激(0．1 ～0．2 ms，20 ～100 V，0．2 Hz)，结果在 11 个(78．6%)MN记录到去极化反应(iPCC-EPSP)，在1个(7．1%)MN记录到超极化反应(iPCC-IPSP)，在2个(14．3%)MN记录到 iPCC-EPSP后复合有iPCC-IPSP的综合反应(图2)，其中阈刺激诱发的iPCC-EPSP的细胞电生理参数列于表2。

图2 同侧中央管周围区(iPCC)局部电刺激在离体脊髓MN记录到的3种突触反应A:兴奋性突触后电位(iPCC-EPSP)，RP为－61 mV;B:抑制性突触后电位(iPCC-IPSP)，RP为 － 65 mV;C:iPCC-EPSP复合 i PCC-IPSP的突触反应，RP为－75 mV。箭头所指为iPCC局部电刺激伪迹Fig2 Distinct synaptic responses recorded in MN by focal stimulation of ipsilateral pericentral canal(iPCC)in spinal cord slicesA:Excitatory postsynaptic potential(iPCC-EPSP)in an MN with RP of－61 mV;B:Inhibitory postsynaptic potential(iPCC-IPSP)in an MNwith RP of－65 mV;C:iPCC-IPSP preceded by iPCC-EPSP in an MN with RPof －75 mV．The arrow indicates iPCCfocal stimulus artifact

表2 离体脊髓运动神经元阈刺激诱发iPCC-EPSPs的细胞电生理参数(¯x±s，n=11)Tab 2 Cellular electrophysiological parameters of iPCC-EPSPs evoked by threshold stimuli in MN in vitro(¯x±s，n=11)

2．2 iPCC-EPSP的细胞电生理特性 对记录到的iPCC-EPSP，改变刺激强度或膜电位水平可观察到幅度具有刺激强度依赖性和膜电位依赖性(图3)，给予低钙高镁溶液或0．1μmol/L TTX灌流15 min后，可逆性取消iPCC-EPSP，表明iPCC-EPSP是化学性突触传递(图4)。

2．3 iPCC-EPSP的药理学性质 在记录到iPCCEPSP的 MN，给予 NMDA受体阻断剂 APV(30 μmol/L)，显示了对iPCC-EPSP的部分抑制作用，再给予非NMDA受体阻断剂DNQX(1μmol/L)，观察到iPCC-EPSP被进一步抑制，但未能完全被取消，其作用可被ACSF部分洗出(图5)。进一步观察抑制性氨基酸受体阻断剂对iPCC-EPSP的影响，结果表明荷包牡丹碱(30μmol/L)和士的宁(1μmol/L)均可增大iPCC-EPSP，在其基础上再给予APV(30 μmol/L)和 DNQX(1μmol/L)，同样仅具有部分抑制iPCC-EPSP的作用，未能完全取消iPCC-EPSP(n=4)，该作用可被ACSF部分洗出(图6)。

图3 iPCC-EPSP的刺激强度依赖性和膜电位依赖性A:iPCC-EPSP的刺激强度依赖性(T:阈强度，数字表示其倍数)，RP为－72 mV;B:iPCC-EPSP的膜电位依赖性，数字表示膜电位，RP为－63 mV。箭头所指为iPCC局部电刺激伪迹Fig 3 Stimulus intensity-and membrane potential-dependent properties of iPCC-EPSPin MN in vitroA:iPCC-EPSP could be graded by varying the stimulus intensity in an MN with RP of －72 mV;T:Threshold intensity of stimulus，the numerals indicate times of T;B:Membrane potential(MP)-dependent property of iPCC-EPSPin an MN with RPof －63 mV．Numbers to the left of each trace are MPs．The arrows indicate iPCC focal stimulus artifacts

3 讨论

本文首先通过对脊髓切片iPCC施加局部电刺激，在全部测试的14个MN均记录到突触反应，说明脊髓iPCC部位的中间神经元与MN之间存在着比较确切的突触联系。尽管记录到的突触反应有iPCC-EPSP、iPCC-IPSP和 iPCC-EPSP后复合 iPCCIPSP三种类型，但在大部分MN诱发的是iPCC-EPSP，并具有刺激强度依赖性和膜电位依赖性，且可以被低钙高镁溶液和TTX可逆性取消，说明在本文的背景实验条件下，iPCC向MN的突触传入是兴奋性化学突触传递占优势，这与报道的形态学结果［2，13－14］、运动控制相关实验结果相吻合［15］。不过，从可以记录到iPCC-IPSP和iPCC-EPSP后复合iPCC-IPSP两种类型的突触反应，特别是抑制性氨基酸受体阻断剂毕扣扣灵和士的宁可明显增大iPCC-EPSP的结果，可以看出在MN活动的背景抑制性调控中，可能有较大的成分来源于iPCC-MN通路，这值得进一步研究。

图4 低钙高镁溶液或TTX(0．1μmol/L)对iPCC-EPSP的影响A和B为来自同一MN的记录，RP为－63 mV。箭头所指为iPCC局部电刺激伪迹Fig 4 Effects of low Ca2+/high Mg2+solution or tetrodotoxin(TTX，0．1 μmol/L)on iPCC-EPSPsA and B are recordings from the same MN with RP of －63 mV．The arrows indicate iPCCfocal stimulus artifacts

图5 谷氨酸受体阻断剂APV和DNQX对iPCC-EPSP的影响NMDA受体阻断剂APV(30μmol/L)和非NMDA受体阻断剂DNQX(1μmol/L)灌流15 min可部分抑制iPCC-EPSP。RP为－78 mV，箭头所指为iPCC局部电刺激伪迹Fig 5 Effects of glutamate receptor antagonists APV and DNQX on iPCC-EPSP in an MNBoth of NMDA receptor antagonist APV(30μmol/L)and non-NMDA receptor antagonist DNQX(1μmol/L)could partially inhibited iPCC-EPSP．RP was －78 mV．The arrow indicates iPCC focal stimulus artifact

在实验中观察到的最主要现象是iPCC-EPSP的特殊药理学性质，即在有背景抑制性输入，或用GABAA受体阻断剂毕扣扣灵和甘氨酸受体阻断剂士的宁取消iPCC-IPSP成分或背景抑制性输入情况下，促离子型谷氨酸受体阻断剂，包括NMDA受体阻断剂APV和非NMDA受体阻断剂DNQX，均只能部分抑制iPCC-EPSP，不能完全取消，说明在iPCC局部电刺激诱发的兴奋性突触传递中，除了谷氨酸通过NMDA受体和非NMDA受体参与介导外，还可能有其他的兴奋性递质的参与，这与已经报道的外周传入、下行激活通路向MN的兴奋性突触传递不同［1，3－10］。至于对 APV 和 DNQX 不敏感成分的来源，在排除了抑制性氨基酸和谷氨酸的促离子型受体后，仍然有多种可能性，包括兴奋性或抑制性谷氨酸其他类型受体、其他神经递质如乙酰胆碱、5-羟色胺等，如该部位存在的胆碱能V0c中间神经元通过C型突触终扣向MN的胆碱能突触传递就是一个重要候选机制［12，16，18］，这需要进一步的实验来证明。

图6 抑制性氨基酸受体阻断剂和谷氨酸受体阻断剂对iPCC-EPSP的影响在荷包牡丹碱(bicuculline，30 μmol/L)和士的宁(strychnine，1 μmol/L)阻断了抑制性氨基酸受体、明显增大iPCC-EPSP的条件下，APV(30μmol/L)和DNQX(1μmol/L)仍然呈现部分抑制iPCC-EPSP的作用。RP为－63 mV，箭头所指为iPCC局部电刺激伪迹Fig 6 Effects of inhibitory amino acid receptor antagonists and glutamate receptor antagonists on iPCC-EPSP in an MNAfter enlargement of iPCC-EPSPby pretreatment of inhibitory amino acid receptor antagonists bicuculline(30 μmol/L)and strychnine(1 μmol/L)，glutamate receptor antagonists APV(30 μmol/L)and DNQX(1 μmol/L)could only partially inhibit iPCC-EPSP．RP was －63 mV．The arrow indicates iPCC focal stimulus artifact

对于iPCC-MN通路突触传递的复杂性，还需要考虑的另一个重要因素就是iPCC局部刺激可能激活的成分或具体通路，可以涉及该部位的不同神经递质的神经元、不同神经递质的纤维，以及可能在iPCC-MN间存在的中间神经元等。如已报道的胆碱能V0c中间神经元通过C型突触终扣与MN联系，而V0c中间神经元接受来自脑干的下行输入、同侧感觉输入以及CPG的节律性输入，其中70%传递到同侧 MN［12］。Miles 和 Muennich 等［18－19］发现MN接受来自中央管周围区V0c中间神经元的C型突触终扣上胆碱能受体的调控，激活M2-AChR可降低动作电位后超极化的幅度从而增强MN的兴奋性，并且M2-AChR的传入可增加在节律性活动中MN的兴奋性。某些脊髓病变，例如萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，其 MN的兴奋性明显改变。Herron等［20］发现在ALS的早期阶段C型突触终扣增大，而这种改变仅在雄性小鼠身上出现，提示C型突触终扣功能紊乱参与了雄性动物ALS的形成。另外有报道［21］，脊髓损伤后MN的兴奋性升高，表现为NMDA受体与胆碱能系统上调，而GABAA系统下调，提示NMDA受体与胆碱能系统在瘫痪症的功能恢复中可能具有积极的协同作用。由此可见，不仅iPCC-MN通路突触传递的神经递质是值得进一步研究的重要内容，同时也具有重要的生物学和临床意义。

［1］ ZHENG C，WANG MY．Effects of etomidate on descending activation of motoneurons in neonatal rat spinal cord in vitro［J］．Acta Physiol Sin，2012，64(2):155 －162．

［2］ REKLING JC，FUNK GD，BAYLISSDA，et al．Synaptic control of motoneuronal excitability［J］．Physiol Rev，2000，80(2):767 －852．

［3］ JIANG ZG，SHEN E，WANG MY，et al．Excitatory postsynaptic potentials evoked by ventral root stimulation in neonate rat motoneurons in vitro［J］．J Neurophysiol，1991，65:57 －66．

［4］ JIANG ZG，SHEN E，DUN NJ．Excitatory and inhibitory transmission from dorsal root afferents to neonate rat motoneurons in vitro［J］．Brain Res，1990，535(1):110 －118．

［5］ 汪丽娜，汪萌芽．离体脊髓运动神经元介导下行激活和外周传入的受体机制［J］．皖南医学院学报，2007，26(1):3 －6，10．

［6］ WANG MY．Responses of motoneurons to ventrolateral funiculus stimulation in neonate rat spinal cord slices［J］．Acta Physiol Sin，1994，46(2):148 －153．

［7］ WANG MY，SHEN E．Characteristics of synaptic responses of motoneurons to ventrolateral funiculus stimulation in vitro［J］．Acta Physiol Sin，1997，49(6):625 －631．

［8］ PINCOM，LEV-TOV A．Synaptic transmission between ventrolateral funiculus axons and lumbar motoneurons in the isolated spinal cord of the neonatal rat［J］．JNeurophysiol，1994，72(5):2406 －2419．

［9］ 张艳，江潇，汪萌芽．对侧腹外侧索电刺激在离体脊髓运动神经元诱发的突触反应［J］．皖南医学院学报，2008，27(5):316－319，323．

［10］汤树森，金建慧，汪萌芽．对侧腹外侧索电刺激在离体脊髓运动神经元诱发突触反应的特性［J］．皖南医学院学报，2009，28(6):391 －394，398．

［11］BRIGGMAN KL，KRISTAN WB．Multifunctional pattern-generating circuits［J］．Annu Rev Neurosci，2008，31:271 －294．

［12］WITTSEC，ZAGORAIOU L，MILES GB．Anatomy and function of cholinergic C bouton inputs to motor neurons［J］．J Anat，2013，doi:10．1111/joa．12063．

［13］FINNEGAN TF，LI DP，CHEN SR，et al．Activation of mu-opioid receptors inhibits synaptic inputs to spinally projecting rostral ventromedial medulla neurons［J］．J Pharmacol Exp Ther，2004，309(2):476－483．

［14］HOCHMAN S，JORDAN LM，MACDONALD JF．N-methyl-D-aspartate receptor-mediated voltage oscillations in neurons surrounding the central canal in slices of rat spinal cord［J］．J Neurophysiol，1994，72(2):565 －577．

［15］ZAGORAIOU L，AKAY T，MARTIN JF，et al．A cluster of cholinergic premotor interneurons modulates mouse locomotor activity［J］．Neuron，2009，64(5):645 －662．

［16］HELLSTROM J，OLIVEIRA AL，MEISTER B，et al．Large cholinergic nerve terminals on subsets of motoneurons and their relation to muscarinic receptor type 2［J］．J Comp Neurol，2003，460(4):476－486．

［17］FRANK E．A new class of spinal interneurons:the origin and function of Cboutons is solved［J］．Neuron，2009，64(5):593 －595．

［18］MILESGB，HARTLEY R，TODD AJ，et al．Spinal cholinergic interneurons regulate the excitability of motoneurons during locomotion［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(7):2448 －2453．

［19］MUENNICH EAL，FYFFE REW．Focal aggregation of voltage-gated，Kv2．1 subunit-containing，potassium channels at synaptic sites in rat spinal motoneurones［J］．JPhysiol，2004，554(Pt 3):673 －685．

［20］HERRON LR，MILESGB．Gender-specific perturbations in modulatory inputs to motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis［J］．Neuroscience，2012，226:313 －323．

［21］WIENECKE J，WESTERDAHL AC，HULTBORN H，et al．Global gene expression analysis of rodent motor neurons following spinal cord injury associates molecular mechanisms with development of postinjury spasticity［J］．J Neurophysiol，2010，103(2):761 －778．