香菇六糖的脱保护反应研究及表征

樊 榕，殷慧清，尹文娟，徐芳芳

（常州兰陵制药有限公司，江苏 常州213018）

许多菌类多糖，如 Lentinan（香菇多糖）[1］、Grifolan（灰树花多糖）[2］、Schizophyllan（裂褶菌多糖）[3］以及Pochyman（茯苓聚糖）[4］等都具有抗肿瘤活性。研究表明，多糖的抗肿瘤活性主要是通过人体的免疫系统起作用而不是直接抑制肿瘤细胞的生长[5］，所以多糖抗肿瘤药物对人体的毒副作用要比其它抗肿瘤药物小很多。已有香菇多糖提取物被作为辅助药物用于临床治疗癌症[6］。然而像大多数天然提取的多糖一样，香菇多糖不能获得很高的纯度，而且分子量常常不确定，因而大大影响了它在临床上的应用。中国科学院生态环境研究中心的宁君首次合成了一系列香菇多糖的核心寡糖片段及其类似物，这些寡糖片段与天然来源的香菇多糖相比，活性相当甚至更好[7］。

香菇六糖的合成通常涉及上保护基和脱保护基，其中脱保护反应是整个合成过程中的关键步骤。宁君等[8］报道的脱保护过程收率较低，导致总收率也大大降低。为了提高收率，作者在此先按专利方法合成香菇六糖的乙酰化化合物，再对脱保护基工艺进行改进，并对所获得的香菇六糖进行了1HNMR、13CNMR、MS表征。脱保护反应过程见图1。

1 实验

1.1 试剂与仪器

所用试剂均为分析纯。

SGW X－4型显微熔点仪（温度计未经校正）；Bruker AM 300MHz型核磁共振仪（D2O为溶剂）；ZAB－2F型质谱仪（英国VG公司）；CARBOSep型糖柱；RI2001型示差折光检测器。

图1 香菇六糖的脱保护反应Fig.1 Deprotection reaction of lentinan

1.2 香菇六糖的脱保护反应

将得到的乙酰化香菇六糖尽量抽干；取25g（0.0095mol），加入100mL二氯甲烷使溶解，再加入500mL通有饱和氨气的甲醇溶液（氨浓度≥6mol·L－1），摇匀，密封，在约25℃下静置反应7d；蒸馏至干，加入500mL通有饱和氨气的甲醇溶液，密封，静置7d；将结晶产物过滤、抽干；加入一定量的乙酸乙酯，搅拌过夜；次日再过滤、抽干，将滤液蒸馏至溶液剩余一半；加入约200mL二氯甲烷使之结晶，过滤，用二氯甲烷洗涤后置于圆底烧瓶中；真空抽干，得约1g产品，加入5mL乙醇，60℃搅拌2h，抽滤，干燥，得淡黄色固体香菇六糖9.1g（0.0092mol）。

1.3 含量测定

采用HPLC法测定香菇六糖含量。

色谱条件：用糖柱 CARBOSep COREGEL－87P（TRANSGENOMIC，No：11720901，8μm，7.8mm×300mm）为填充柱；流动相为去离子水；柱温80℃；示差折光检测器温度40℃；流速0.5mL·min－1。理论塔板数按香菇六糖峰计算应不低于500，三者分离度均应符合规定。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

香菇六糖，收率96.8%，熔点180～184 ℃；1HNMR，δ：5.32（d，1H），4.71（2H，与水峰相重叠），4.50（d，2H），4.22～4.11（m，4H），3.99～3.37（m，33H）；13CNMR，δ：105.42，105.38，105.34，101.72，87.86，87.65，85.39，84.49，78.58，78.50，78.47，78.26，78.21，78.13，76.47，76.05，75.75，75.71，74.84，73.76，73.41，72.46，72.23，71.57，71.01，70.89，70.38，64.32，63.36，63.16；MS：990.4（M峰），991.4（M＋1峰），1012.4（M＋Na峰），1013.4（M＋1＋Na峰），1014.4（M＋2＋Na峰）。

2.2 样品含量测定

取获得的香菇六糖适量，精密称定，加水定量稀释成1mg·mL－1的香菇六糖溶液，作为供试品溶液。精密量取10μL供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；另取香菇六糖对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成1mg·mL－1的溶液，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算，测得含量为99.89%。

2.3 讨论

（1）在脱保护反应中，要求乙酰化香菇六糖的纯度较高，在TLC薄层层析时不得有杂质点出现，否则会影响最终收率。

（2）香菇六糖极易潮解。首次过滤出来的产物由于纯度不高，不易潮解；而再次加入二氯甲烷进行重结晶所获得的产物，必须快速抽干，否则易潮解。对二次过滤产物需要加入无水乙醇（每克产品加入无水乙醇5g）进行洗涤。

（3）测定含量时，由于香菇六糖的特殊性，需要使用糖柱为填充柱。若使用氨基色谱柱，将会在样品主峰出峰后出现倒峰，对测定有干扰；若选用蒸发散射检测器，无论以何种比例的流动相，均会出现裂缝。柱温对香菇六糖的含量测定同样存在影响，若使用60℃柱温，主峰将会变成2个峰，并且噪音较大，结果不理想。

3 结论

对香菇六糖的脱保护反应进行工艺改进，使香菇六糖收率提高至96.8%，含量达到99.89%，并对所获得的香菇六糖进行了1HNMR、13CNMR、MS表征。为香菇六糖的进一步研究奠定了基础。

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