降解2，6-二叔丁基苯酚菌种的驯化与鉴定

马海娟

(开朗(上海)生态科技有限公司，上海 201203)

含酚有机物被广泛地用于木材防腐剂、防锈剂、杀菌剂和杀虫剂等，是化工、钢铁等工业废水的主要有毒成分。其对许多微生物具有抑制毒害作用，在环境中难以被微生物分解。国内外有许多对这类物质生物降解研究的报告［1-3］，但对2，6-二叔丁基苯酚(2，6-DTBP)生物降解报道很少［4］。2，6-二叔丁基苯酚是受阻酚类抗氧化剂的主要母体，广泛用于橡胶、化纤等行业，同时又是合成医药中间体的重要原料，也可直接用作润滑油抗氧剂。该物质对水中的鱼类、藻类和微生物有很大的毒害作用［5］，且难于生物降解［6］。本研究以2，6-二叔丁基苯酚为唯一碳源，通过菌种采集、平板分离纯化，初步筛选出对2，6-二叔丁基苯酚有降解作用的菌株。对筛选出的多株菌种进行对底物降解作用的考察，从中选出实验所用菌种，对其驯化，并进行了形态学、生理生化以及分子生物学的鉴定，以期为高效降解工业废水提供优良的微生物菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 采自上海某石化腈纶厂废水处理站的塔式生物滤池和沉淀池水，经分离和筛选得到1株能降解2，6-二叔丁基苯酚的M-Z-8菌株。

1.1.2 试验底物 2，6-二叔丁基苯酚(2，6-DT-BP)，分析纯，由北京助剂研究所提供。

1.1.3 萃取剂 正己烷，分析纯(≥97.0%)，由中国医药(集团)上海化学试剂公司提供。

1.1.4 培养基 肉汤培养基［7］:牛肉膏5 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 L，pH 7.2(固体培养基另加琼脂16 g);Bushnell-Hass(B.H.)基础培养基［8］:MgSO40.2 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO41 g，CaCl20.02 g，K2HPO41 g，FeCl3(60%)2 滴浓缩液，蒸馏水 1 L，pH 7.0。

1.1.5 菌悬液 将32℃下生长24 h的斜面菌种接种到装有30 mL肉汤培养基的250 mL三角烧瓶中，在37℃、250 r/min的恒温摇床中培养24 h。然后将种子液经过3次离心(8000 r/min，每次10 min，4 ℃)、2次水洗(用0.85%无菌生理盐水)，最后用同样的生理盐水稀释成一定浓度(以单位体积的细胞湿重(w/v)表示)的菌悬液。

1.2 方法

1.2.1 驯化及其效果考察 ①菌种驯化:将3 mL浓度为3%的M-Z-8菌株菌悬液接种到含30 mL的B.H.基础培养基的三角烧瓶中，加入浓度为500 mg/L的2，6-二叔丁基苯酚作为唯一碳源和能源。在37℃、250 r/min的摇床中培养，待培养基溶液明显浑浊后，再取上述驯化液3 mL接种到含浓度为500 mg/L的2，6-二叔丁基苯酚的30 mL新鲜B.H.基础培养基中继续驯化。重复多次，最后取上述驯化液进行效果实验;②驯化效果考察方法:分别取未经驯化的斜面菌种和4次驯化后的菌液接种到肉汤培养基上增殖，30℃恒温培养20 h后，制备成3%的菌悬液。再接种1 mL菌悬液到底物浓度为100 mg/L的30 mL B.H.基础培养基(pH=7.0)中(相当于接种量为0.1%)。将未接种和接种的三角瓶置于37℃、250 r/min摇床培养，相隔一定时间取样，测定2，6-二叔丁基苯酚的浓度变化。

1.2.2 样品分析 ①检测条件的确定:采用UV-2201型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)分析2，6-二叔丁基苯酚的浓度变化。通过对不同浓度的样品扫描，发现276 nm为2，6-二叔丁基苯酚的紫外特征吸收波长，故选择在λ=276 nm时测定样品;②样品预处理及分析:在含30 mL样品溶液的各摇瓶(包括空白对照样品瓶)中加入10 mL正己烷，振荡2 min后迅速倒入离心管，4℃、8000 r/min条件下在Sorvall SuperT21离心机上离心8 min，抽取上清液2 mL，于10 mL容量瓶中定容至刻度，276 nm处用紫外-可见分光光度计测定2，6-二叔丁基苯酚的浓度。

1.2.3 菌种的鉴定 主要参照伯杰氏手册［9-10］和其他相关的文献［11-12］，通过形态和生理生化等特征研究，对本研究所使用的菌种进行鉴定。①菌落特征:在肉汤培养基琼脂平板上划线接种，30℃培养3 d，观察菌落特征;②菌体形态:菌体涂片后，采用结晶紫简单染色法进行染色，然后在光学显微镜下(放大1500倍)观察菌体形态、大小。采用革兰染色法观察菌株的革兰染色结果。通过透射电镜观察鞭毛数量及着生位置等特征。

1.2.4 菌种的16S rDNA序列分析 ①细菌总DNA提取:用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀提取总DNA;②PCR引物:采用细菌16S rDNA通用引物F27(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和 R1492(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')通过PCR扩增供试菌的16S rDNA片段［13］;③PCR扩增、产物回收、连接转化以及测序:用引物对模板做PCR扩增反应，PCR的反应体系:10 × PCR Buffer 5 μL，MgCl25 μL，dNTP 1 μL，F27引物 2 μL，R1492 引物 2 μL，Template 0.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 39 μL。反应为35个循环，95℃保温10 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min;35个循环后再72℃延伸10 min。凝胶回收试剂盒回收凝胶上的PCR产物，用pMD18-T载体(大连宝生物公司)进行连接，转化大肠埃希菌DH5α的感受态细胞，然后挑取单克隆至4 mL氨苄抗性的LB培养基中37℃、250 r/min培养过夜。在2%的琼脂糖胶上电泳后，将胶进行染色，紫外灯下观察，与克隆前PCR产物的大小一致，确定为阳性克隆。将确定为阳性克隆的菌体进行测序;④同源性比较:将测序结果用BLAST软件与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 菌种的驯化效果

菌种驯化的方式各种各样，由于菌种对污染物具有一个适应的过程，可通过逐渐提高污染物底物浓度的方式，也可直接在高浓度下或通过诱变等方式对菌种进行驯化培养。本实验采用高浓度情况下对菌种进行驯化，来获得高活性的2，6-二叔丁基苯酚降解菌种。

图1所示的结果表明，未经驯化的M-Z-8菌株在12 d的时间里对2，6-二叔丁基苯酚的去除率为40.1%，而经过4次驯化后的菌种在相同条件下对底物的平均去除率达到了51.6%，与未驯化菌种相比，经驯化后的菌种对100.0 mg/L浓度的底物降解率提高了12%。

图1 驯化M-Z-8菌株对底物降解的影响Fig.1 The effect of acclimation on 2，6-DTBP degradation by M-Z-8

一般而言，当菌种进入到一个新环境时，对污染物存在着一段时间的适应期［14］。在此适应期内，微生物要通过诱导酶的合成，而且需要合成必需的辅酶或中间代谢物，来达到对污染物的适应，这期间对污染物的生物降解速率很小。一旦微生物被驯化，微生物便表现出很高的生物降解能力。在生物降解的后期，可能是由于降解产物的积累导致产生反馈抑制作用，也可能产生一些代谢产物改变了培养液理化性能，或产生一些有毒物质影响菌种生长，造成随后的降解速率趋于平缓。

2.2 鉴定结果

2.2.1 形态特征 菌体形态:M-Z-8菌株为革兰阴性细菌，杆状，单个或2个存在，大小为(0.3～0.5)μm ×(1.0 ～3.0)μm，极生鞭毛(见图2)。

图2 M-Z-8菌株的透射电镜图(20000×)Fig.2 TEM of M-Z-8 strain(20000 × )

M-Z-8菌株菌落呈圆形，Φ1.0～2.0 mm，蜜黄色，不透明，表面光滑，湿润，低凸起，边缘整齐。

2.2.2 生理生化特征 表1列出了菌株M-Z-8的生理生化特征试验结果。

表1 菌株M-Z-8的生理生化特征Table 1 Physiological＆biochemical characteristics of M-Z-8 strain

根据实验结果并结合文献资料，确认M-Z-8菌株符合气单胞菌属(Aeromonas)的特征，将M-Z-8菌株鉴定为气单胞菌(Aeromonas sp.)。

2.2.3 16S rDNA序列分析及其同源性比较 以M-Z-8菌株的总DNA为模板，利用对细菌16S rDNA特异的引物F27和R1492进行PCR扩增，得到长约1.5 kb的PCR扩增产物，将获得的1.5 kb扩增产物进行DNA序列测定，结果见图3。

图3 M-Z-8菌株的16S rDNA核苷酸序列Fig.3 The sequence of 16S rDNA fragment of M-Z-8 strain

用BLAST程序对M-Z-8菌株的16S rDNA序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，结果发现与多株气单胞菌种属的16S rDNA核苷酸序列同源性均在97%以上，其中包括Aeromonas hydrophila、Aeromonas molluscorum、Aeromonas encheleia、Aeromonas eucrenophila、Aeromonas salmonicida 和 Aeromonas popoffii，与生理鉴定结果吻合，对于其准确的分类地位需要结合其他的细菌学手段予以确定。

3 讨论

以2，6-二叔丁基苯酚为唯一碳源对初筛得到的菌种进行驯化，获得了1株对2，6-二叔丁基苯酚有较强降解能力的菌种。该菌株经过驯化后，对底物的生物降解能力比未驯化时有所提高，说明其对环境的适应能力有了提高。

通过对菌株进行的形态学以及生理生化鉴定，初步表明M-Z-8菌株为气单胞菌种属(Aeromonas sp.)。

对M-Z-8菌株的16S rDNA序列进行核苷酸同源性比较，与气单胞菌种属的16S rDNA核苷酸序列同源性均在97%以上，包括Aeromonas hydrophila、Aeromonas molluscorum、Aeromonas encheleia、Aeromonas eucrenophila、Aeromonas salmonicida和Aeromonas popoffii。其与生理鉴定结果相吻合。

［1］Huban C M，Plownman R D.Bioaugmentation:Put microbes to work［J］.Chemical Engineering，1997，104(3):74-84.

［2］徐威，关海滨，宋明，等.高效苯酚降解菌的选育及降酚特性［J］.微生物学杂志，2008，28(1):68-71.

［3］沈齐英，申林波.苯酚好氧降解菌的驯化和筛选［J］.微生物学杂志，2002，22(6):15-16，42.

［4］张志刚.固定化优势菌降解2，6-二叔丁基酚的研究［J］.中国西部科技，2007，8(9):1-2.

［5］U.S.Environmental Protection Agency.G034.2，6-Di-tertbutylphenol test results［128-39-2］.

［6］张亚雷.难降解有机废水(腈纶废水)处理工艺及其污染物生物降解性能研究［D］.上海:同济大学，1999:77-79.

［7］胡家骏，周群英.环境工程微生物学［M］.北京:高等教育出版社，1988:226.

［8］Bushnell L D，Hass H F.The utilization of certain hydrocarbons by microorganisms［J］.Journal of Bacteriology，1941，41(5):653-673.

［9］Krieg N R，Holt J G.Bergey's manual of systematic bacteriology(Volume 1)［M］.Baltimore:The Williams＆ Wilkins Co.，1984:361-373.

［10］Holt J G，Krieg N R，Sneath P H A.Bergey's manual of determinative bacteriology(9th ed.)［M］.Baltimore:The Williams＆ Wilkins Co.，1994:75，131.

［11］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京:科学出版社，2001:66，106-107，117-119，370-383.

［12］中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定手册［M］.北京:科学出版社，1978:8，64-71.

［13］徐玉泉，张维，陈明，等.一株苯酚降解菌的分离与鉴定［J］.环境科学学报，2000，20(4):450-455.

［14］王菊思，赵丽辉，匡欣.合成有机化合物的生物降解性研究［J］.环境化学，1993，12(3):161-172.