基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在结膜松弛症成纤维细胞中的表达△

韩竹梅 张兴儒 柯梅青 倪振华 符之瑄 李青松 项敏泓

结膜松弛症(conjunctivochalasis，CCh)是年龄相关性老年人常见眼病［1］，CCh的发病机制与球结膜成纤维细胞功能发生改变［2-3］，球结膜组织弹力纤维减少，胶原纤维融解［3-4］，球结膜厚度变薄［5-6］，及球结膜组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表达过强［7］，球结膜成纤维细胞MMPs与基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)表达失衡有关［8］。MMPs 可降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，TIMPs是特异性MMPs抑制剂，二者共同维持ECM的合成及降解平衡。2012年1～12月通过检测CCh球结膜成纤维细胞中MMPs及TIMPs的表达，旨在进一步探讨结膜松弛症的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 CO2培养箱(SANYO公司，日本)，超净工作台(苏净集团安泰公司)，倒置显微镜(WILOVERT公司，德国)，低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)，酶标检测仪(BIO-RAD公司，美国)，DMEM培养基、青霉素-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶溶液(上海博谷生物科技有限公司)，成纤维细胞生长添加物(FGS)(北京裕恒丰生物科技有限公司)。MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 ELISA试剂盒(上海明睿生物有限公司)。收集上海中医药大学附属普陀医院眼科手术室2012年1～12月病例资料。CCh组:随机选择CCh手术切除的松弛结膜13例(13眼)，按照Zhang［9］的分级标准，Ⅱ级2眼，Ⅲ级8眼，Ⅳ级3眼，年龄54～82岁，平均(68.08±8.42)岁。正常对照组:为年龄配对的单纯白内障超声乳化手术的病例16例(16眼)，年龄56～85岁，平均(70.14±8.43)岁。均获得上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准及患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养［10］将切取的球结膜组织放入准备好的无菌装有9 g/L生理盐水的一次性药碗内漂洗3次，除去血污;用眼科显微剪刀将其剪成0.5～1 mm2大小组织块，平铺于六孔板内，翻转底朝上放置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，观察6孔板内组织块近干;翻转6孔板底朝下，缓慢加入3 mL含10%体积胎牛血清和青霉素-链霉素、0.1%FGS的DMEM培养液，且勿使组织浮起，继续培养;每3天换液1次，在倒置相差显微镜下观察接种组织块贴壁及培养液情况。经过倒置显微镜对细胞形态观察及免疫荧光和流式细胞术对成纤维细胞特异性蛋白的检测，鉴定为成纤维细胞。

1.2.2 ELISA 检测细胞上清液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3的质量浓度 选取3～6代呈对数生长期细胞，将生长至90%的细胞消化后，用含10%体积胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，以2.5×105个/mL浓度接种于24孔板中，每孔为l mL。培养24 h后，弃去原培养液，加无血清DMEM培养液，每孔1 mL，每组设3个复孔，然后置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱中，培养48 h后，收集各孔培养上清液，高速离心机(相对离心力为152×g)离心20 min，取上清液，置于无菌EP管中，分装后-20℃冷冻保存，用 ELISA 检测其中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 浓度，按试剂盒说明书操作。用酶标仪在450 nm波长处测量各孔的吸光度(A450)OD值，利用标准品OD值及其相对应的浓度，以OD值为横坐标，浓度为纵坐标，作一标准曲线并用公式表现出来，将样本的OD值代入计算即可得出样本浓度。

1.3 统计学方法 统计学处理采用 SPSS16.0统计学软件进行统计，各组检测指标数据资料经W检测呈正态分布，经Levene检验方差，检测平均浓度值用以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，以 P＜0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

采用ELISA检测，得到各个标本中MMPs、TIMPs浓度表达。MMP-1的表达:CCh成纤维细胞的浓度明显高于正常对照组，差异有统计学意义(F=0.40，P＜0.05)。MMP-3的表达:CCh成纤维细胞的浓度明显高于正常对照组，差异有统计学意义(F=0.79，P＜0.01)。TIMP-1的表达:CCh成纤维细胞的浓度与正常对照组比较，差异无统计学意义(F=1.05，P＞0.05)。TIMP-3的表达:CCh成纤维细胞的浓度明显低于正常对照组，差异有统计学意义(F=0.74，P＜0.05)。见表 1。

表1 两组成纤维细胞中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3浓度比较(，ng/mL)

表1 两组成纤维细胞中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3浓度比较(，ng/mL)

注:a示与CCh组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)

MMP-1 MMP-3 TIMP-1 TIMP-3 CCh组组别437.62 ±13.62 0.29 ±0.02 0.48 ±0.00 0.17 ±0.01正常对照组 404.74 ±9.68a 0.15 ±0.02a 0.49 ±0.01 0.19 ±0.00a F值0.40 0.79 1.05 0.74 P值 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05

3 讨论

随着人口老年化加快，CCh的患病人数将不断增多。Zhang等［1，9］报道，60 岁及以上人群中 CCh 患病率为44.08%。近年研究发现MMPs及TIMPs参与了球结膜ECM稳态的调节，其功能失调可能参与了CCh的病理过程［7-8］。

MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶，包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等，是以ECM成分为水解底物的蛋白酶家系，主要在ECM的降解和重建中起作用。在正常的生理状态下，ECM处于不断产生和降解的动态平衡中;病理状态下，ECM的产生和(或)降解失平衡使其过多堆积 ，从而导致组织病理学方面的改变，产生相应的疾病。

MMPs主要分为 5 类，其中，胶原酶(MMP-l、8、13)主要降解 I、Ⅱ、Ⅲ型胶原;基质降解酶(MMP-3、7、10、11、12)广泛降解ECM。TIMPs是机体自发产生的特异性抑制 MMPs功能的一组蛋白质，目前研究发现TIMPs的 成 员 有 4 个:TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。它们可下调MMPs的活性，对于维持ECM的稳态有重要作用。TIMP-1是体内MMP-1的天然特异性组织抑制剂，可抑制 MMP-1酶原活化及其活性。TIMP-3是一种结合细胞外基质的非可溶性蛋白，调节MMP-3蛋白水解活性，协调ECM的降解与重建。在生理条件下，MMPs和TIMPs之间保持动态平衡，以确保正常生理功能的进行;但在某些病理条件下，这种生理平衡状态被打破，从而对组织表现出极大的破坏力而致病。MMPs和TIMPs表达水平失衡与眼科疾病的发生、发展密切相关。

李青松等［7］研究显示CCh球结膜组织中MMP-1、MMP-3表达较高，MMPs与 TIMPs平衡失调。Meller等［11］对CCh与正常结膜的成纤维细胞研究发现，CCh组结膜成纤维细胞MMP-1和MMP-3过度表达。Li等［8］对正常结膜和CCh来源的结膜成纤维细胞进行培养研究发现，CCh患者成纤维细胞MMP-1和MMP-3蛋白表达在CCh中明显增加，分别为正常组的3.5～7.6倍及2.3～13倍。在 CCh中，MMP-3的酶蛋白溶解活性和MMP-1的胶原酶溶解活性增强。这些研究结果提示MMPs与TIMPs的失衡导致了球结膜基质和Tenon囊的过度降解，而发生CCh。

本研究中采用ELISA检测细胞培养上清液中MMPs的表达情况，采用CCh成纤维细胞的培养方法［10］，选取3～6代呈对数期生长的成纤维细胞，排除了原代培养中可能存在的上皮细胞。简单纯化了体外实验的研究环境，排除了细胞混杂因素的干扰，直接检测CCh成纤维细胞培养上清液中 MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3 的表达。

本研究中CCh组成纤维细胞MMP-1、MMP-3呈高表达，表明大部分释放出胞外，胞内贮存的较少，证实了CCh是多种因素导致ECM的改变，使细胞内大部分MMP-1、MMP-3释放到细胞外维持ECM的稳定。TIMP-1的表达与正常对照组比较没有统计学意义，证实了细胞内外MMP-1/TIMP-1失去平衡。TIMP-3的表达明显低于正常对照组，释放到细胞外的较少，大部分储存在细胞内，证实了细胞内外MMP-3/TIMP-3失去平衡。这些研究结果提示在CCh中MMP-1的表达水平明显升高，而TIMP-1并没有随之相应的升高，同时，MMP-3的表达水平明显升高，而TIMP-3的表达却降低，上述球结膜成纤维细胞MMPs及TIMPs的病理表达可能参与了CCh的发生。对于MMPs、TIMPs的表达改变的机制及途径还需进一步深入的研究。

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