桔皮中橙皮苷的新型双水相萃取

朱红菊 ， 丁 玉 ， 贾亚伟

（1.中国矿业大学 国家煤加工与洁净化工程技术研究中心，江苏 徐州221116；2.中国矿业大学 化工学院，江苏 徐州 221116；3.江苏洋河酒厂股份有限公司技术中心，江苏 宿迁 223800）

橙皮苷具有抗氧化、降血脂、消炎、维持渗透压、增强毛细血管韧性及降低胆固醇等作用[1-3]，被广泛用于医药及日用化工等领域[4-6]。同时，作为天然抗氧化剂、食品添加剂、果蔬保鲜剂及保健品等，也被食品行业广泛应用。

传统的双水相体系是由两种水溶性高分子或一种水溶性高分子与无机盐组成的混合体系。与其他常规分离方法相比，其显著特点及独有的技术优势在于：由于两相均为水相，故两相界面张力极低，大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，故相分离条件温和，相间传质和平衡过程迅速，产物回收率高。另外，低的界面张力有助于保持被分离物质的生物活性，特别适合于分离有生物活性的物质，在生物大分子等生物类产品的分离过程中得到广泛应用[7]。基于此，为了增加双水相体系的选择性，近年来有诸如双水相与其它分离技术的集成化、亲和双水相等萃取技术的不断发展[8-10]。但这类双水相体系的主要不足是用于分离的高分子聚合物价格昂贵、难以回收、黏度大、聚合物难处理及环境污染等[11]，限制了它们的工业化应用。

近年来，先后出现了无机盐-低分子有机溶剂双水相体系[12]、离子液体双水相体系[13-15]，以及表面活性剂的双水相体系[16]等。这类双水相体系具有传统体系所没有的一些特点，如分相快、成本低、易于处理等。其中以无机盐/低分子有机溶剂形成的双水相体系最为价廉、易得，近年来得到广泛应用[17-20]，且多以微波、超声等手段辅助，以增强萃取效果。用于黄酮类化合物提取的这类双水相体系主要是由一些低分子醇类与硫酸铵构成[17-18，20]，多用于不同天然产物中黄酮类物质的分离。但这类体系对橙皮苷的选择性如何，则研究较少，而对于除低分子醇类之外的有机溶剂更少有人涉及。由于分离是利用目的产物与杂质的性质不同而进行，故萃取介质的不同必然会影响目的产物的分离程度。因此，有必要对低分子醇类以外的有机溶剂及硫酸铵以外的盐类的双水相构成及性质进行研究，以寻求最佳的双水相萃取体系，丰富双水相的构成。

作者采用新型亲水性低分子有机溶剂/无机盐双水相体系纯化橙皮苷，辅以纤维素酶助提取，考察不同的低分子有机物质及无机盐类对橙皮苷纯化的影响。采用制备型高效液相色谱（HPLC）对其进一步纯化。用HPLC检测所得橙皮苷的纯度及橙皮苷回收率，以考察新型双水相体系对橙皮苷的分离特异性及其纯化效率。

1 材料与方法

1.1 粗提物制备

市购蜜桔取皮、清洗、冷冻干燥至恒重。粉碎、过40目筛，所得桔皮粉冷藏备用。

取适量桔皮粉于锥形瓶中，加入乙醇并辅以纤维素酶，水浴振荡浸提30 min后灭酶、冷却，抽滤得粗提液待用。

1.2 双水相成相

关于乙醇、丙醇等低分子醇类与硫酸铵形成的双水相体系研究者众多，故本研究取异丙醇、丙酮及3种无机盐类构建双水相体系，进一步考察这类物质的成相性质及对目的产物的选择性。

分别取异丙醇/（NH4）2SO4、异丙醇/Na2CO3、异丙醇/K2HPO4、丙 酮/（NH4）2SO4、 丙酮/Na2CO3、丙 酮/K2HPO46对物质进行研究，用浊点法绘制各自双节线图（相图），考察最优成相、萃取体系。

1.3 双水相体系萃取

将一定量构成双水相体系的有机溶剂、无机盐置于离心管中，取橙皮苷粗提液与之混合，调节pH，旋涡混合，一定温度下恒温萃取一定时间后，记录两相体积，用紫外分光光度法测定橙皮苷浓度。计算相比R，分配系数K和回收率Y。

1.4 橙皮苷粗品制备

将双水相上相溶液加质量分数1%盐酸溶液调pH为4.0，加热至65℃，冷却过夜结晶，过滤洗涤数次，真空冷冻干燥得橙皮苷粗品。

1.5 制备型HPLC精制

将所得粗品用流动相稀释至相应浓度，与标准品溶液及流动相进行超声处理，过0.45 μm的滤膜后上样。梯度洗脱，收集主要峰值流出液。

制备条件：色谱柱DAC-HB50-C18（Φ50 mm×250 mm，10 μm）；紫外检测器，检测波长 286 nm；柱温为室温；进样量15 mL；流动相体积流量55 mL/min。

1.6 相关计算

1.6.1 双水相萃取收率

式（1）中：R为双水相体系上下相体积之比；K为双水相体系分配系数。

1.6.2 相比

式（2）中：Vt，Vb为双水相体系上、下相体积，mL。

1.6.3 分配系数

式（3）中：Ct，Cb为上、下相中橙皮苷的质量浓度，mg/mL。

1.6.5 总回收率Y计算

2 结果与讨论

2.1 双水相体系萃取橙皮苷

2.1.1 双水相体系成相研究 一般认为，普通有机物形成双水相是盐溶液与有机溶剂争夺水分子形成缔合水合物的结果。通过绘制双水相双节线图，选择合适的双水相体系。3种盐分别与丙酮、异丙醇构成双水相体系，见图1。

图1 不同双水相体系的成相相图Fig.1 Phase diagram for different aqueous two-phase Systems

由图1可以看出，碳酸钠形成稳定的双水相体系所需盐及醇量均较少，意即其分相能力最强。磷酸氢二钾具有较宽的分相范围。

2.1.2 双水相体系构成对橙皮苷选择性的影响取碳酸钠与磷酸氢二钾进一步研究，分别与异丙醇、丙酮构成4组双水相体系，即异丙醇/Na2CO3、异丙醇/K2HPO4、丙酮/Na2CO3、丙酮/K2HPO4体系，探讨橙皮苷粗品在两相间的分配情况，考察体系对橙皮苷的选择性。各体系的成相相比、分配系数及橙皮苷收率见表1。

表1 橙皮苷在不同双水相体系中分配效果比较Table 1 Comparison ofhesperidin partitioning in different aqueous two-phase systems

由表1可知，橙皮苷在丙酮/K2HPO4体系中虽然相比不太理想，但分配系数较大，表明该体系的选择性较高，其回收率Y1可达到93.77%。因而确定丙酮/K2HPO4体系作为萃取橙皮苷的适宜双水相体系。

2.1.3 丙酮和K2HPO4质量浓度对橙皮苷选择性的影响 取系统总质量20 g，加入相当0.20 g橙皮苷的粗提液，在pH 9.0、室温情况下，考察K2HPO4、丙酮质量浓度对橙皮苷粗品在两相间的选择性及回收率的影响，结果如图2所示。

由图2可知，K2HPO4、丙酮质量分数对橙皮苷粗品的萃取效果影响较为显著；当K2HPO4质量分数一定时，随着丙酮量的增加，分配系数K和萃取率Y1总是先明显上升，而后趋于平稳或略有下降。这是由于体系分相能力随丙酮量增加而增大，更有利于橙皮苷分配于上相，提高萃取率；但丙酮质量分数过高，就会有更多的水进入上相，而使分配系数降低，同时K2HPO4的水化作用不足以夺取这些水分子而出现盐析现象。而K2HPO4的量也不宜太高，否则导致相比进一步降低，加之盐析的同时作用，会造成橙皮苷萃取率下降，导致原料浪费。欲提高萃取收率Y1，必须同时考虑分配系数K和相比R两个参数的作用。因此，取质量分数28%丙酮-质量分数20%K2HPO4构成的双水相体系作为后续萃取体系。

图2 K2HPO4、丙酮质量浓度对橙皮苷粗品选择性影响Fig.2 Effect of dipotassium hydrogen phosphate and acetone concentration on the selectivety of crude hesperidin

2.1.4 粗提物用量对橙皮苷选择性的影响 仍取系统总质量为20 g、pH 9.0，室温操作，固定K2HPO4质量分数为20%、丙酮质量分数28%，考察粗提物加入量对橙皮苷萃取过程的影响，结果示于表2。

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由表2可以看出，分配系数K、萃取率Y1随着粗提物量的加大而不断波动，但在用量达到0.4 g后，相比下降，Y呈现下降趋势。综合考虑，取粗提物用量为0.4 g。

2.1.5 温度对橙皮苷分配系数的影响 固定上述条件，即系统总质量20 g，K2HPO4质量分数20%、丙酮质量分数28%，pH 9.0，粗提物加入量0.4 g。不同温度下橙皮苷粗品的萃取收率与分配系数等参数变化如表3所示。

表2 粗提物用量对橙皮苷分配的影响Table 2 Effect of the amount of crude hesperidin on its partitioning

表3 温度对橙皮苷分配系数的影响Table 3 Effect of temperature on the partition coefficient of crude hesperidin

由表3可知，随着温度上升，分配系数略有增加，相比未见变化，橙皮苷的萃取收率几乎无变化。出于操作方便和节能降耗的考虑，萃取温度取为室温。

2.1.6 pH值的影响 萃取条件固定为：系统总质量为20 g，K2HPO4质量分数为20%、丙酮质量分数为28%，室温，粗提物加入量0.4 g。一般而言，丙酮/K2HPO4双水相体系成相时，溶液pH范围在7～12之间。因此，考察此区间内pH值对橙皮苷粗品萃取过程的影响，结果见表4。

表4 pH值对橙皮苷分配系数的影响Table 4 Effect of pH value on the partition coefficient of crude hesperidin

由表4可知，pH值在7～10之间时，随着pH值的增加，相比R与分配系数K不断增大，橙皮苷萃取收率上升趋势显著，pH=10时萃取收率达到最大值。pH大于10后，相比与选择性均降低，萃取收率亦缓慢下降。这可能是因为在pH＜10时，随着pH的增加，溶液中水解产生的H2PO4-减少而HPO42-相应有所增加。负电荷的增多致使其对橙皮苷酚羟基氧负离子的排斥作用增强，从而促使更多的橙皮苷分配于上相，提高了橙皮苷的分配系数。pH＞10后，K2HPO4会进一步电离，上、下相的差别缩小，从而使得橙皮苷的选择性减少。最后导致其萃取收率下降。

2.2 HPLC制备橙皮苷

2.2.1 流动相及洗脱方式对橙皮苷分离的影响以甲醇溶剂为对照液，用紫外可见分光光度计对质量浓度1.5 mg/mL的橙皮苷标准品于波长200～600 nm之间进行全波长连续扫描，发现在286 nm处有特征吸收峰。因此，以286 nm为检测波长，对双水相纯化后的橙皮苷样品进行HPLC精制纯化。

配制质量浓度为1.0 mg/mL的样品溶液，按一定的色谱条件进行HPLC实验。考察不同流动相及洗脱方式对样品分离效果的影响。按以下3种洗脱方式进行考察：

1）纯甲醇洗脱方式。

2）固定 v（甲醇）∶v（水）=45∶55 的洗脱方式。

3）梯度洗脱方式。以甲醇与水的初始体积比例为40∶60开始，不断增加甲醇比例至二者体积比例达到1∶1。而后，逐渐恢复初始比例，直至洗脱结束。所得结果分别示于图3—5。

图3 纯甲醇洗脱时样品的流出情况Fig.3 Elution profile while methanol as the elution solvent

图4 v（甲醇）∶v（水）=45∶55 比例洗脱时样品流出情况Fig.4 Elution profile of sample when the ratio of methanol to water is 45∶55

图5 梯度洗脱时样品流出情况Fig.5 Elution profile of sample as gradient elution strategy

由图3—5可见，流动相为纯甲醇时，出峰时间较早，但是分离效果较差，并且有拖尾现象和溶剂峰干扰；流动相为甲醇-水（体积比 45∶55）时，出峰时间较适宜，峰形较佳，但部分组分不能完全分开；流动相为梯度洗脱时，出峰时间适中，每个组分基本可逐一分离，但个别峰有前滞现象。综合考虑，采取梯度洗脱法精制橙皮苷。

2.2.2 HPLC精制橙皮苷 按以上色谱条件对样品进行精制。以质量浓度1.5 mg/mL的标准品作为基准，对相当质量浓度3.0 mg/mL的样品进行梯度分离。收集峰流出液，真空旋转蒸发浓缩，回收甲醇溶剂。所得产品用去离子水洗涤数次，真空干燥得橙皮苷精制品。

2.3 产品纯度分析 分别将橙皮苷标准品、双水相纯化样品及HPLC精制样品配制成质量浓度为20 μg/mL的溶液，用HPLC分析色谱对各样品进行分析，通过面积归一化方法计算各出峰组分的百分比，近似看作各组分的质量分数。3种样品的色谱如图6—8所示。

根据图6橙皮苷标准品的分析色谱图，可知图7中出峰时间7.380 min即第4个峰为橙皮苷，面积归一化得面积分数71.36%，即双水相纯化后的橙皮苷干样品纯度约为71.36%。

图6 橙皮苷标准品分析图谱Fig.6 HPLC chromatogram of the standard hesperidin

图7 双水相纯化样品分析图谱Fig.7 HPLC chromatogram of purified hesperidin

图8 HPLC精制品分析图谱Fig.8 HPLC chromatogram of the refined hesperidin

图8中保留时间7.375 min处的峰与橙皮苷标准品（7.373 min）保留时间一致，归一化面积分数为96.09%，即制备型HPLC系统制备得到的橙皮苷干品纯度约为96.09%。

制备型HPLC精制橙皮苷回收率

则橙皮苷总回收率

由双水相纯化样品的分析图谱可以看出，丙酮/K2HPO4体系对橙皮苷有一定的富集、纯化作用。对照标准品可知，除主要成分橙皮苷外，还有其他的一些杂质存在。由于缺少对应物质的标准品，尚不能确定它们是哪种物质。这有待于以后的进一步研究。而经制备色谱精制后的样品已经与标准峰值基本无异，说明制备色谱对于橙皮苷类物质的纯化十分有效。

3 结语

1）采用不同类型有机溶剂/无机盐双水相体系分离纯化橙皮苷粗提物，效果不同。实验条件下，以丙酮/K2HPO4体系效果较好。其最佳萃取条件为：K2HPO4质量分数为20%、丙酮质量分数为28%；室温，pH 10，粗提物用量0.4 g。其时，相比R为1.25，分配系数K为23.36，萃取回收率96.69%。

2）丙酮/K2HPO4双水相萃取体系对橙皮苷有一定的选择性，可达到70%以上的纯度，纯化倍数达20倍以上。但其选择专一性还有待进一步研究。

3）制备型HPLC的流动相洗脱方式对橙皮苷的分离效果有一定影响。实验条件下，以甲醇-水梯度洗脱方式纯化效果较好。

4）丙酮/K2HPO4双水相体系纯化后的橙皮苷样品的纯度约71.36%，制备型HPLC精制所得橙皮苷干品纯度可达到96.09%，且回收率较高。

5）本实验橙皮苷总回收率约为83.54%。

6）由丙酮/K2HPO4构成的双水相体系选择性较高，K2HPO4是生物活性物质的常用缓冲溶液用药品，由此构成的双水相体系更适合于具有生物活性的天然物质的萃取分离，值得对此作进一步研究。

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