抗菌肽F1粗提物稳定性及其对荔枝保鲜研究

周国海,陈飞龙,陈咏春,苗建银,戴良惠,彭 勃,方倩敏,曹 庸

(1. 泰州学院医药与化学化工学院,江苏泰州 225300;2.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;3.广东省天然活性物工程技术研究中心,广东广州 510642)



抗菌肽F1粗提物稳定性及其对荔枝保鲜研究

周国海,陈飞龙,陈咏春,苗建银,戴良惠,彭 勃,方倩敏,曹 庸

(1. 泰州学院医药与化学化工学院,江苏泰州 225300;2.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;3.广东省天然活性物工程技术研究中心,广东广州 510642)

为了研究抗菌肽F1粗提物抗菌活性稳定性,并探讨其对荔枝的保鲜效果,将经过0.05%抗菌肽F1粗提物、0.1%抗菌肽F1粗提物及0.05%施保克浸泡处理之后的荔枝分别在(25±3) ℃和(4±1) ℃下贮藏。其中,(4±1) ℃下的贮藏实验,增加了复合药液组(抗菌肽F1粗提物、施保克的比例为1∶1,两者终浓度为0.025%)。每隔一段时间,测定各组荔枝的好果率、褐变指数、质量损失率、硬度、可溶性固性物、还原糖、维生素C含量等指标。结果表明,抗菌肽F1粗提物能够存放较长的时间,耐冻融,对常见的金属离子具有一定的抵抗力,且几乎无溶血性,安全性高。另外,它能够抑制荔枝果皮褐变及果肉软化,延缓果肉可溶性固形物、还原糖和维生素C含量的下降,保持荔枝的良好品质。研究还发现,抗菌肽F1粗提物与施保克复合使用,比单一保鲜剂的保鲜能力更强。荔枝经复合药液处理之后,在(4±1) ℃下贮藏到第21 d时,好果率高达71.43%。

抗菌肽F1粗提物,稳定性,荔枝,保鲜,果实,品质

抗菌肽F1是由副干酪乳杆菌坚韧亚种产生的既能对多数细菌又能对真菌产生抑菌作用的新型抗菌肽,并且它具有极强的耐热性及较好的酸解和酶解耐受性[1]。同时,其粗提物抗菌范围广泛,对常见的食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)、常见的水产致病菌(嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌)及霉菌均具有较强的抑制作用[2-3]。另外,之前的研究还发现抗菌肽F1粗提物在牛奶、馒头、冷鲜肉及鲜虾中具有较好的防腐保鲜作用,能有效地抑制腐败菌的生长,维持食品的良好品质,并无食品安全性问题[3-5]。因此,抗菌肽F1粗提物在食品防腐保鲜领域中极具应用前景。

随着人们食品安全意识的提高及现今农药残留问题的日益严重,水果的新鲜度和营养价值越来越受到人们的关注和重视,人们对水果的食用品质也提出了更高的要求,并逐渐开始重视水果防腐保鲜剂的应用。中国是水果生产大国,更是荔枝的主产国,其种植面积与产量均居世界首位。但荔枝与多数热带水果一样,果实采后生理代谢旺盛,导致它在贮藏过程中极易发生果皮褐变、果肉软化、果实腐烂等品质劣变的问题,不耐贮藏。目前,在生产实践中,荔枝主要使用的是化学防腐保鲜剂,可是频繁或过量地使用化学防腐保鲜剂将会导致微生物耐药、化学防腐保鲜剂残留、果实品质劣变等问题,存在安全隐患,不符合人们对高品质荔枝的要求[6]。因此,安全卫生、天然无毒、高效广谱、活性稳定的天然保鲜剂的开发和应用已成为荔枝防腐保鲜的研究热点。本研究对抗菌肽F1粗提物活性稳定性、安全性进行分析,并将抗菌肽F1粗提物应用于荔枝,结合(25±3) ℃和(4±1) ℃保藏,考察其对荔枝防腐保鲜的效果,为开发荔枝的新型天然防腐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

抗菌肽F1粗提物 实验室自制[5];“桂味”荔枝 果实成熟度为8成,果实充分着色呈鲜红色,单果重20～30 g,购自广州天平架水果批发市场;施保克 江门市大光明农化新会有限公司;指示菌 金黄色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcus aureus ATCC25923),华南农业大学食品学院微生物实验室保藏;培养基 广东环凯微生物科技有限公司;化学试剂 天津市福晨化学剂厂。

PL203型电子天平 梅特勒托利多仪器有限公司;BCD-206TAS冰箱 海尔集团;LC-15C型高效液相色谱仪、UV-1750型紫外可见光分光光度计、EZTest型拉力实验机 岛津仪器(苏州)有限公司;FD-1PF型立式冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司;KQ500-B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;HWS-24电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;手持式折光仪 衢州艾普计量仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗菌肽F1粗提物的成分分析 采用HPLC法测定抗菌肽F1粗提物中乳酸和抗菌肽F1的含量。根据孙晶等[7]和Miao等[1]的方法,对抗菌肽F1粗提物进行前处理并上样检测。

1.2.2 抗菌肽F1粗提物稳定性研究

1.2.2.1 存放时间对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响 将抗菌肽F1粗提物冻干粉于25 ℃保藏,于第0、5、10、15、20、30 d取出部分冻干粉,用超纯水溶解,以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用96孔稀释法[3]测定其最低抑菌浓度。实验设置3个重复,结果取平均值。

1.2.2.2 冻融次数对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响 用超纯水配置200 mg/mL的抗菌肽F1粗提物母液。然后抗菌肽F1粗提物母液反复经-20 ℃冷冻及流动水解冻,每次解冻之后,取部分母液以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用96孔稀释法[3]测定其最低抑菌浓度。其中,冻融次数为0、1、2、3、4、5次,实验设置3个重复,结果取平均值。

1.2.2.3 金属离子对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响 分别配制1 000 mmol/L的氯化钠、氯化钾和100 mmol/L的氯化钙、氯化镁、三氯化铁母液,以及200 mg/mL的抗菌肽F1粗提物母液。然后,将盐溶液和F1粗提物混合,并使得Na+、K+的高、中、低浓度分别为500、50、10 mmol/L,而Ca2+、Ba2+、Fe3+、Cu2+的高、中、低浓度分别为50、5、1 mmol/L。接着,将所得的混合液于30 ℃放置1 h后,以金黄色葡萄球菌为指示菌,采用96孔稀释法[3]测定其最低抑菌浓度。实验设置3个重复,结果取平均值。

1.2.3 抗菌肽F1粗提物溶血性测定 对Hou等[8]的方法进行修改,分析抗菌肽F1粗提物对小鼠红细胞溶血活性。选取正常健康的大鼠进行摘除眼球采血,用抗凝管收集血液,4 ℃离心(4000 r/min,7 min),小心吸取下层红细胞,加入PBS缓冲液并离心洗涤3次。用PBS缓冲液将红细胞重悬为5%的细胞悬液。取300 μL红细胞悬液于透明玻璃试管中,同时,加入不同浓度的抗菌肽F1粗提物溶液100 μL,塞紧试管口后置于生化培养箱37 ℃培养4 h。最后,目测法观测是否有溶血现象。

1.2.4 抗菌肽F1粗提物对荔枝的保鲜评价

1.2.4.1 实验分组及前处理 本实验购买了两批荔枝,将新鲜荔枝剔除虫果,选择大小均一、无黑点、无机械损伤的留蒂荔枝,用清水清洗干净。待荔枝自然风干后,其中一批于(25±3) ℃贮藏,随机分为4组,分别用0.05%抗菌肽F1粗提物、0.1%抗菌肽F1粗提物、0.05%施保克和蒸馏水(对照组)浸泡2 min后放在通风处快速风干,轻放在泡沫箱(长×宽×高为330 mm×255 mm×310 mm,壁厚20 mm)中,密封,置于(25±3) ℃贮藏,并定期对荔枝的理化指标等进行检测。另外一批荔枝于(4±1) ℃贮藏,随机分为0.05%抗菌肽F1粗提物组、0.1%抗菌肽F1粗提物组、0.05%施保克组、对照组和复合药液组(抗菌肽F1粗提物、施保克的比例为1∶1,两者的终浓度为0.025%),处理同上。

表1 存放时间对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响(X±SD,n=3)

表2 冻融次数对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响(X±SD,n=3)

表3 金属离子对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响(X±SD,n=3)

注:Fe3+、Cu2+、Ba2+、Ca2+的高、中、低浓度分别为50、5、1 mmol/L;K+、Na+的高、中、低浓度分别为500、50、10 mmol/L。

1.2.4.2 指标的测定方法 a.好果率：采用李念文等[9]的方法。荔枝果皮霉斑直径大于10 mm或果皮褐变面积超过果皮面积的1/2时,则认为该荔枝已失去商品价值。好果率(%)=完好果数/检查总果数×100

b.荔枝果皮褐变指数：根据Zhang等[10]的方法稍做修改,即荔枝的褐变指数主要根据外果皮进行判定:在同样的拍摄条件下,定期对荔枝进行拍摄,每只荔枝每个侧面拍摄3次,一共拍摄6次,获得的相片,运用Image-Pro Plus 6.0软件分析,计算出褐变面积占总面积的比例,再结合感官评定,对荔枝进行分级。褐变分级标准:1级果无褐变或褐变面积小于果皮面积的1/4;2级果褐变面积占果皮面积1/4～1/2;3级果褐变面积占果皮面积1/2～3/4;4级果褐变面积大于果皮面积的3/4;5级果为完全褐变或腐烂。褐变指数=∑(褐变级数×各级褐变果数)/实验果实总数。

c.失重率：失重率(%)=(贮前果实质量-不同贮藏期的果实质量)/贮前果实质量×100。

d.果肉硬度的测定：参考Liang等[11]的方法,使用拉力实验机进行测定。

e.果肉可溶性固形物：依据Cabral等[12]的方法,使用手持式折光仪测定。

f.果肉还原糖的测定：参考Hajare等[13]的方案,采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定。

g.果肉维生素C的测定：根据Nisperos-Carriedo等[14]的方法,采用HPLC法测定。

1.2.5 数据处理 运用SPSS Statistics 17.0对所有测定的指标进行显著性分析(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽F1粗提物的成分分析

抗菌肽F1粗提物中含有乳酸和抗菌肽F1这两个抗菌成分,其中乳酸的含量为12.51%±0.36%,抗菌肽F1的含量为0.051%±0.003%。

2.2 抗菌肽F1粗提物稳定性研究

2.2.1 存放时间对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响 从表1可以看出,抗菌肽F1粗提物在25 ℃下保存30 d后,其对金黄色葡萄球菌的抑菌活性无显著变化(p>0.05),表明抗菌肽F1粗提物可以在25 ℃下保藏较长时间。同时,当冷藏时间较长时(4 ℃超过15个月),抗菌肽F1粗提物冻干粉复溶之后,溶液仍与冻干前的发酵液一样澄清透明,比较其和最初得到的抗菌肽F1粗提物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)无显著差异(p>0.05),表明抗菌肽F1粗提物也可在冷藏条件下长期保存。

2.2.2 冻融次数对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响 在-20 ℃冻藏过程中,反复冻融可能会使得抗菌肽F1粗提物中的有效成分的构型发生改变,结果影响其生物学活性。如表2所示,抗菌肽F1粗提物经过反复冻融5次之后,对指示菌金黄色葡萄球菌的抑菌活性没有显著性影响(p>0.05),表明抗菌肽F1粗提物经反复冻融之后仍然保存良好的抗菌活性,稳定性好。

2.2.3 金属离子对抗菌肽F1粗提物抗菌活性的影响 由表3可知Cu2+、Ca2+、K+在高、中、低浓度下与抗菌肽F1粗提物作用后的抑菌效果与对照(未经金属离子作用的抗菌肽F1粗提物)比较均无显著性差异(p>0.05)。Fe3+、Na+则在高浓度时对抗菌肽F1粗提物的抑菌效果有显著的抑制作用(p<0.05),而在高、中浓度的Ba2+作用下,抗菌肽F1粗提物的抑菌效果都受到显著抑制(p<0.05),且Ba2+浓度越高对抗菌肽F1粗提物的抑菌效果越强。因此,抗菌肽F1粗提物对常见的金属离子具有一定的抵抗力。

另外,前期研究发现抗菌肽F1粗提物具有较好的耐酸、耐热、耐光照性[2],即抗菌肽F1粗提物在常见的理化条件下,能够保持稳定高效的抗菌活性。

2.3 抗菌肽F1粗提物的溶血性

在前期研究[2-3]中,发现抗菌肽F1粗提物对细菌、霉菌的最低抑菌浓度在3.13～6.25 mg/mL范围内。而如表4所示,30 mg/mL的抗菌肽F1粗提物对红细胞无溶血性,即抗菌肽F1粗提物在有效抑菌的浓度下,无溶血性,安全性高。同时,抗菌肽F1粗提物由几千年的制作及食用历史的开菲尔中的副干酪乳杆菌FX-6以牛奶为原料发酵后获得的,因此,抗菌肽F1粗提物来源安全,天然无毒。

表4 不同浓度下抗菌肽F1粗提物的溶血活性

2.4 抗菌肽F1粗提物对荔枝的防腐保鲜效果

图1 荔枝在贮藏过程中好果率的变化Fig.1 Changes in healthy rate of litchi during storage注:A:25 ℃;B:4 ℃;图2～7同。

2.4.1 抗菌肽F1粗提物对荔枝好果率的影响 荔枝在贮藏过程中好果率的变化如图1所示,随着荔枝贮藏时间的延长,各组荔枝的好果率均呈下降趋势,对照组的好果率下降速度显著快于其他实验组(p<0.05)。进一步比较发现,无论25 ℃贮藏还是4 ℃贮藏,经施保克、抗菌肽F1粗提物处理的荔枝果实的好果率均高于对照果实。如荔枝在25 ℃贮藏第3 d时,对照组、0.05%施保克、0.05%抗菌肽F1粗提物和0.1%抗菌肽F1粗提物组的好果率分别为13.33%、21.43%、25.81%和33.33%。另外,荔枝在4 ℃贮藏第21 d时,对照组、0.05%施保克、0.05%抗菌肽F1粗提物、0.1%抗菌肽F1粗提物和复合药液组的好果率分别为25.47%、48.95%、47.80%、60.43%和71.43%。因此,施保克、抗菌肽F1粗提物及复合药液有利于保持较高的荔枝果实好果率。另外,在4 ℃贮藏中,复合药液组的效果显著优于其他组(p<0.05)。

2.4.2 抗菌肽F1粗提物对荔枝褐变指数的影响 如图2所示,在第1 d时,经0.05%施保克处理的荔枝果实的褐变指数显著大于其他组(p<0.05),而其他组的褐变指数之间无显著差异(p>0.05),说明采用施保克处理荔枝会导致荔枝果皮变暗,而抗菌肽F1粗提物及复合药液对荔枝的果皮无显著影响。在25 ℃贮藏中,对照组的褐变指数上升趋势最显著(p<0.05),说明施保克、抗菌肽F1粗提物都可有效抑制地荔枝褐变,而抗菌肽F1粗提物的浓度越高其效果越好。荔枝在25 ℃贮藏到第3 d时,对照组荔枝的果皮几乎全部褐变,同时霉菌也大量生长,已失去商品价值;0.05%施保克组荔枝的果皮大部分发生褐变,同时其果皮上还有一些霉菌生长;0.05%抗菌肽F1粗提物组荔枝的果皮较大部分发生了褐变,但无霉菌生长;0.1%抗菌肽F1粗提物组的荔枝果皮只有小部分发生褐变,且无霉菌生长。因此,抗菌肽F1粗提物延缓荔枝果皮的褐变,并抑制荔枝果皮微生物的生长,从而达到较好的防腐保鲜效果。

图2 荔枝在贮藏过程中褐变指数的变化Fig.2 Changes in browning index of litchi during storage

2.4.3 抗菌肽F1粗提物对荔枝失重率的影响 荔枝的水分含量丰富,其失重率主要是由于水分的损失导致的,而荔枝失水过多将会导致荔枝的品质下降。由图3可见,无论荔枝在25 ℃还是4 ℃下贮藏,施保克、抗菌肽F1粗提物组荔枝的失重率都显著低于对照组(p<0.05),这可能是因为施保克及抗菌肽F1粗提物能够抑制荔枝腐烂,使得荔枝组织结构保持一定的完整性,减少质量的损失。

图3 荔枝在贮藏过程中质量损失率的变化Fig.3 Changes in weight loss rate of litchi during storage

2.4.4 抗菌肽F1粗提物对荔枝果肉硬度的影响 荔枝在贮藏过程中果肉硬度的变化如图4所示,在贮藏第1 d,各处理组荔枝的果肉硬度无显著差别(p>0.05),即抗菌肽F1粗提物、施保克对荔枝的果肉硬度无不良影响。随着贮藏时间的延长,25 ℃和4 ℃下贮藏的各组荔枝的果肉硬度迅速下降,其中对照组下降的速度显著快于其他组(p<0.05),说明抗菌肽F1粗提物、施保克能够在一定程度上抑制减缓荔枝果肉软化,从而对荔枝的品质起到一定的保护作用。同时,0.05%施保克组荔枝果肉硬度下降的速度显著快于0.05%抗菌肽F1粗提物组、0.1%抗菌肽F1粗提物组,这说明抗菌肽F1粗提物组减缓荔枝果肉软化的效果优于施保克。

图4 荔枝在贮藏过程中果肉硬度的变化Fig.4 Changes in firmness of litchi during storage

2.4.5 抗菌肽F1粗提物对荔枝可溶性固形物、还原糖含量的影响 适宜的可溶性固形物和还原糖含量能赋予荔枝良好的风味和口感。由图5和图6可以发现,随着贮藏时间的延长,各组荔枝的可溶性固形物和还原糖均呈下降趋势,其中对照组的可溶性固形物和还原糖的下降幅度最快。在25 ℃和4 ℃贮藏末期,对照组的可溶性固形物及还原糖的含量显著低于其他处理组(p<0.05)。因此,抗菌肽F1粗提物、施保克及复合药液均有利于果实可溶性固形物和还原糖含量的保持。

图5 荔枝在贮藏过程中可溶性固形物含量的变化Fig.5 Changes in TSS content of litchi during storage

图6 荔枝在贮藏过程中还原糖含量的变化Fig.6 Changes in reducing sugar content of litchi during storage

2.4.6 抗菌肽F1粗提物对荔枝维生素C含量的影响 维生素C是重要的营养物质,对人体健康非常重要,但在贮藏加工中,维生素C很容易被氧化破坏。如图7所示,无论荔枝是置于25 ℃贮藏还是置于4 ℃贮藏,随着贮藏天数的增加,其维生素C含量逐渐下降,但是经施保克、抗菌肽F1粗提物、复合药液处理之后的荔枝果实,其维生素C降解速度显著小于对照组(p<0.05)。

图7 荔枝在贮藏过程中维生素C含量的变化Fig.7 Changes in VC content of litchi during storage

3 结论

3.1 本实验中,使用的抗菌肽F1粗提物中含有12.51%±0.36%的乳酸及0.051%±0.003%的抗菌肽F1。

3.2 抗菌肽F1粗提物能够存放较长的时间,耐冻融,对常见的金属离子具有一定的抵抗力。并且抗菌肽F1粗提物几乎无溶血性,安全性高。

3.3 抗菌肽F1粗提物能有效地延缓荔枝果实可溶性固形物、维生素C、还原糖等物质的消耗,较好地保持荔枝的风味和贮藏品质。同时,抗菌肽F1粗提物可以显著抑制荔枝发生褐变,提高荔枝的贮藏效果。

3.4 在4 ℃下贮藏,抗菌肽F1粗提物和施保克复合使用对荔枝的防腐保鲜效果最明显,到贮藏末期(第21 d),荔枝的好果率仍高达71.43%,说明抗菌肽F1粗提物能够与其他防腐保鲜剂复合使用。

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Research about preservation of litchi and stability of crude extracts of antimicrobial peptide F1

ZHOU Guo-Hai1,CHEN Fei-Long2,CHEN Yong-Chun2,MIAO Jian-Yin2,3,DAI Liang-Hui2,PENG Bo2,FANG Qian-Min2,CAO Yong2,3,*

(1.College of Pharmacy and Chemistry & Chemical Engineering,Taizhou University,Taizhou 225300,China;(2.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642;China;3.Guangdong Engineering Research Center of Natural Active Substance,Guangzhou 510642,China)

Study on the activity stability of crude extracts of antimicrobial peptide F1 and investigate the effects of it on the preservation of litchi fruits. After litchi fruits were treated with the 0.05% crude extracts of antimicrobial peptide F1,0.1% crude extracts of antimicrobial peptide F1 and 0.05%Sportak,they were kept fresh at(25±3) ℃ and(4±1) ℃. Beside,litchi fruits storaged test at(4±1) ℃ add the composite liquid group(crude extracts of antimicrobial peptide F1,sportak ratio was 1∶1,the final concentration was 0.025%). The healthy rate,browning index,pulp firmness,soluble solid content,reducing sugar content,vitamin C content of litchi were measured at regular intervals. The results showed that crude extracts of antimicrobial peptide F1 could be stored a long time,freeze-thaw resistance,security and it had a certain resistance to metal ions. Besides,compared to the control,crude extracts of antimicrobial peptide F1 treatments could effectively preserve litchi fruits,inhibite pericarp browning and flesh softening during storage. Moreover,crude extracts of antimicrobial peptide F1 treatments could dramatically decrease the nutrient consumption of soluble solids,reducing sugar and vitamin C. It could be concluded that crude extracts of antimicrobial peptide F1 treatments could improve storability of litchi fruits at(25±3) ℃ and(4±1) ℃.In addition,the preservation of the mixture of crude extracts of antimicrobial peptide F1 and Sportak was stronger than single preservative. The compounds treatments could significantly preserve litchi fruits,and health fruit rate was 71.43% at(4±1) ℃ for 21 days.

crude extracts of antimicrobial peptide F1;stability;litchi;fresh-keeping;fruit;quality

2016-05-06 +并列第一作者

周国海(1964-),男,本科,教授,研究方向:植物化学,E-mail:zjjzgh@163.com。

陈飞龙(1992-),男,硕士研究生,研究方向:食品科学,E-mail:feilong42@163.com。

国家自然科学基金资助项目(31171768);广东省教育厅科研项目(2013gjhz0003)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000

*通讯作者:曹庸(1966-),男,博士,教授,研究方向:食品化学与营养,E-mail:caoyong2181@scau.edu.cn。