超高压处理对大米蛋白功能特性及结构的影响

管弋铦,何 苗,熊双丽

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010)



超高压处理对大米蛋白功能特性及结构的影响

管弋铦,何 苗,熊双丽

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010)

以不同压力(200、400、600 MPa)对大米进行超高压处理。研究了超高压处理对大米中谷蛋白功能特性以及清蛋白、球蛋白和谷蛋白结构的影响。结果表明:超高压处理后大米蛋白的功能特性和二级结构均发生变化,不同压力影响效果不同。200 MPa时蛋白质的溶解性、持水性和乳化性提高,持油性降低;400 MPa时持水性和乳化性降低,持油性提高,溶解性升高不明显;600 MPa时溶解性、持水性、持油性和乳化性均降低。超高压处理后清蛋白、球蛋白和谷蛋白的二级结构发生改变,β-折叠结构含量降低,无序结构增多。相关性分析结果表明压力、功能特性和二级结构三者之间存在相关。

超高压,功能特性,结构,相关分析

全球有超过一半的人口将大米作为主食。大米中蛋白质含量占8%左右[1]。按Osborne分级分离法可从大米中分离出四种溶解性不同的蛋白:清蛋白,球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[2-4]。其中,谷蛋白占大米总蛋白的80%以上;球蛋白占的8%～10%左右,清蛋白和醇溶蛋白含量均不超过5%。谷蛋白、球蛋白和水溶性的清蛋白对大米品质有重要影响,谷蛋白的功能特性是大米食用品质和加工特性的重要影响因素之一。

超高压技术是一项高新的食品加工技术。超高压处理食品原料时,可以在不影响或少影响食品的色泽、风味以及营养价值的前提下使食品中淀粉和蛋白质等大分子物质的性质发生改变,从而改变原料的加工特性[5-6]。侯磊等[7]研究了0.8%的柠檬酸溶液浸泡大米时进行超高压处理,随着压强的升高,大米淀粉的糊化度逐渐增强,大米的老化度显著降低,米饭的品质得到提高。朱转等[8]研究表明,大米浸泡和超高压预处理使米饭淀粉中抗性淀粉的含量降低,慢速消化淀粉和快速消化淀粉的含量升高,米饭的消化特性得到提高。高嘉琦[9]研究发现大米超高压处理后制得的米饭在色泽、嚼劲性和弹性等方面均优于对照样品。目前关于大米超高压处理的研究热点主要是大米淀粉特性和大米食用品质方面,而对蛋白质性质研究相对较少。本文选用不同压力对大米进行超高压处理,分级分离出清蛋白、球蛋白和谷蛋白三种主要蛋白,通过红外光谱分析三种蛋白质的结构变化,研究谷蛋白的溶解度、持水性、持油性、乳化性等功能性质变化以及他们与谷蛋白结构之间的相关性,深入分析超高压处理大米过程中蛋白质的变化及其对大米加工性质的影响,为超高压技术在新型大米制品开发中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

珍珠米、粳型米 黑龙江省大庆丰源农业科技有限公司萨尔图分公司,主要成分:水分含量为13.39%,蛋白质含量为10.80%,淀粉含量为75.58%;氯化钠、无水乙醇、氢氧化钠、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、硼酸、无水硫酸铜、甲基红、溴甲酚绿、硫酸 均购自天津市福晨化学试剂厂 均为分析纯。

HPP.L2-800/1型食品高压设备 天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司;DZ400-DZ(2 L)型真空封装机 四川成都瑞昌仪器制造有限公司;FT-IR5700傅里叶变换红外光谱仪 美国热电;离心机 中国上海科析实验仪器厂;PHS-3C酸度计 上海雷磁仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大米粉的制备 首先将大米除杂、粉碎,过60目筛,制成大米粉,用塑封袋装好后置于干燥器中备用。

1.2.2 超高压处理 大米粉碎后,称取一定质量的大米粉,加入40%的去离子水,搅拌混匀后装入PE袋中。抽真空密封后,在20 ℃条件下,以压力(200、400、600 MPa),15 min分别对大米进行超高压处理。加压时升压速度为50 MPa/s,卸压速度为100 MPa/s。高压处理后的大米粉与10倍体积的95%乙醇迅速混匀脱水,抽滤后再与少量无水乙醇混匀并抽滤,所得米粉在25 ℃下鼓风干燥2 h后研磨成粉,过80目筛,装入塑封袋中并置于干燥器内备用。另称取一定量的大米粉于烧杯中,添加40%的去离子水,混匀后静置15 min作为未经高压处理的空白对照。

1.2.3 大米蛋白提取 称取高压处理前后的大米粉200 g,参考Osborne 的方法[2]分级提取大米中的清蛋白、球蛋白和谷蛋白。具体操作如下:

处理后的大米粉→蒸馏水提取(固液比1∶3,室温,2 h)→离心(5000 r/min,25 min)→沉淀→5%Nacl溶液提取(固液比1∶3,室温,2 h)→离心(5000 r/min,25 min)→沉淀→洗涤两次→70%乙醇提取(固液比1∶3,室温,2 h)→离心(5000 r/min,25 min)→沉淀→洗涤两次→0.05 mol/L NaOH溶液提取(固液比1∶3,室温,2 h)→离心(5000 r/min,25 min)。

保留去离子水、5% Nacl溶液和0.05 mol/L NaOH溶液提取离心后的上清液,用2 M HCl调节等电点沉淀蛋白质,离心所得蛋白质沉淀洗涤2次后冷冻干燥,得清蛋白、球蛋白和谷蛋白样品。所得蛋白质样品纯度均在83.79%以上。

1.2.4 谷蛋白功能性测定

1.2.4.1 溶解性测定 参考汪昔琴[10]的方法并稍有改动。准确称取0.5 g谷蛋白样品,加入30 mL去离子水,在室温下搅拌40 min后5000 r/min离心10 min,取上清液用考马斯亮蓝G-250法测蛋白质浓度,用微量凯氏定氮法测定未处理样品中的含氮量,按下式计算氮溶解度:

氮溶解度=上清液中含氮量/样品总含氮量×100

1.2.4.2 持水性和持油性的测定 参考文献[11]。

1.2.4.3 乳化性的测定 乳化性测定:乳化性测定参考钟昔阳并略有改动[12]。配制3%的大米谷蛋白悬浮液,取25 mL该悬浮液与25 mL色拉油混合,用匀浆机以10000 r/min速度搅打1 min,使其充分形成水-油乳化物,将上述乳化物装入10 mL有刻度的离心管中,以1500 r/min离心5 min,测量乳化层体积和液体总体积,按照下列公式计算样品的乳化性:

1.2.5 大米三种蛋白红外分析 采用傅里叶红外变换光谱(FTIR)分析大米中的三种蛋白。准确称量2 mg的样品,加入100 mg溴化钾,用研钵研磨成均匀粉末,压制成薄片,再用红外光谱仪做全波段扫描(400～4000 cm-1),扫描次数128次。数据处理采用PeakFit 4.12软件(SPSS Inc.Chicago,IL,USA),Omnic软件(Nicolet,USA)和Origin8.0软件(OriginLab Corp.,Northampton,MA,USA)。

1.3 数据分析

每组实验重复3次,所有数据均以平均值±标准差(X±SD)给出,数据处理采用SPSS 11.5(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)统计分析软件(p<0.01)。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对大米谷蛋白功能性质的影响

2.1.1 超高压处理对大米谷蛋白溶解性的影响 蛋白质的溶解性是蛋白质最重要功能性质之一,溶解性的大小直接影响蛋白质的可利用价值。

蛋白质溶解性主要反映了蛋白质的水化作用,超高压处理可以破坏蛋白质的肽键或氨基酸侧链极性基团与水分子的相互作用,从而改变其溶解性[13]。大米谷蛋白属于水不溶性蛋白,本身在水中的溶解性很差。由图1可以看出200 MPa时谷蛋白溶解性提高到7.15%,400 MPa时升高至7.34%,600 MPa时溶解性下降至5.82%。200 MPa下蛋白质分子结构松散,促进肽键伸展,侧链极性基团水化作用增强,溶解性提高。400 MPa时由于蛋白质分子内一部分疏水基团暴露,抑制了水化作用的提高。600 MPa处理时疏水基团暴露增多,水化作用减弱,溶解性降低。另外,解缔的蛋白质分子在高压力下重新聚集也会使溶解性降低[14]。

图1 超高压处理对大米谷蛋白溶解性的影响Fig.1 Changes in solubility of the glutenin after ultra high pressure treatment

2.1.2 超高压处理对大米谷蛋白持水性和持油性的影响 食品加工中蛋白质主要影响食品的口感和风味,蛋白质的持水性能主要影响食品的质地和口感,持油性能影响油脂保留能力,与食品风味密切相关。因而,蛋白质的持水性和持油性对食品加工而言十分重要。

从图2可知,200 MPa处理时蛋白质吸水量提高且达最大值4.71 mL/g,400 MPa时吸水量降低,600 MPa时进一步降低。形成这一现象的原因可能是200 MPa处理时蛋白质分子伸展,形成了较好的蛋白质框架,同时亲水基团暴露增多,蛋白质水化能力增强,持水能力提高[15]。随着压力的增大,隐藏在蛋白质分子内部的疏水基团逐渐暴露出来,蛋白质与水分子结合的能力降低,持水能力下降。另外,高压下松散的蛋白质重新凝聚也会导致持水能力下降。

图2 超高压处理对大米谷蛋白持水性的影响Fig.2 Changes in water holding capacity of the glutenin after ultra high pressure treatment

由图3可知,200 MPa时谷蛋白的吸油量降低至最小值1.42 mL/g,400 MPa时有所提高,达到最大值2.59 mL/g,600 MPa时吸油量下降至1.58 mL/g。这一现象可能是由于200 MPa处理时亲水基团水化能力增强,蛋白质亲油性减弱,吸油量下降。压力增大后疏水基团的暴露使谷蛋白亲油性增加,持油能力回升。压力继续升高后解缔蛋白的重新凝集可能是导致持油能力下降的原因之一。

图3 超高压处理对大米谷蛋白持油性的影响Fig.2 Changes in oil holding capacity of the glutenin after ultra high pressure treatmen

2.1.3 超高压处理对大米谷蛋白乳化性的影响 蛋白质所能降低油-水界面表面张力的能力是决定其乳化能力的关键因素[16]。由图4可知,超高压处理提高了大米谷蛋白的乳化能力。200 MPa处理时蛋白质乳化性提高至最大值33.89%,400 MPa时乳化能力有所降低,600 MPa时进一步降低。这一现象可能是由于200 MPa时压力作用使蛋白质分子结构受到破坏,极性基团水化作用增强,亲水性提高,并且与疏水基团共同作用,使亲水性和亲油性达到较好平衡,宏观上表现为乳化能力提高。随压力逐渐增大,由于蛋白质发生进一步聚集,导致吸附到油水界面上蛋白减少,所以乳化性又呈下降[17]。

图4 不同压力处理下大米谷蛋白乳化性的比较Fig.4 Changes in emulsifying ability of the glutenin after ultra high pressure treatment

2.2 红外结果分析

清蛋白、球蛋白和谷蛋白作为大米蛋白中3种主要的蛋白质,影响着大米的质地、口感和营养价值,超高压处理下这三种蛋白的结构变化可以为大米品质的变化提供依据。

图5 超高压处理后大米三种蛋白的红外光谱Fig.5 FT-IR spectroscopy of three kinds proteins in rice after ultra high pressure treatment

图5为不同压力处理条件大米三种蛋白红外图谱,对蛋白质中的C=O、N—H和C—N的振动方式与二级结构有关,红外在多个波段对这些的振动方式均有吸收,其中,酰胺Ⅰ带(1600～1700 cm-1)以C=O的伸缩振动为主[18],对蛋白质二级结构变化的反映相对比较简明,因而酰胺Ⅰ带的特征频率常被用来表征蛋白质的二级结构。本研究选取大米谷蛋白、清蛋白和球蛋白红外光谱的酰胺Ⅰ带来分析大米谷蛋白和球蛋白二级结构的组成变化,采用Peakfit软件对蛋白质酰胺I带进行解析。

表1 超高压处理后大米三种蛋白二级结构含量变化(%)

注:同列不同字母表示差异极显著,p<0.01。酰胺Ⅰ带谱峰指认如下:1610～1640 cm-1和1690～1700为β-折叠,1640～1650 cm-1为无规则卷曲;1650～1660 cm-1为α-螺旋结构;1660～1690 cm-1为β-转角结构[19-20]。

由表1可知大米谷蛋白二级结构以β-折叠为主,占44.48%,其次为β-转角,无规则卷曲含量最少。超高压处理降低了β-折叠和α-螺旋的含量。200 MPa时β-折叠和α-螺旋的含量均极显著下降(p<0.01),β-折叠含量达到最小值34.42%,400 MPa时α-螺旋的含量继续下降达到最小值11.00%,β-折叠的含量极显著升高(p<0.01),600 MPa时两者含量均极显著升高(p<0.01)。无规则卷曲含量变化与α-螺旋相反。β-转角的含量在200 MPa时极显著升高(p<0.01),400 MPa时极显著下降(p<0.01),600 MPa时极显著升高(p<0.01),达到最大值35.04%。α-螺旋和β-折叠通过氢键分别维持着蛋白质分子内和分子间的有序性。超高压处理能够破坏蛋白质的氢键[21],200 MPa时两者含量下降也说明了这种氢键作用力减弱,促进了蛋白质分子伸展。400 MPa时β-折叠的含量回升,分子间的氢键作用力提高,但α-螺旋结构维持的分子内氢键作用继续减弱。600 MPa时两者含量增加,氢键作用力增强,蛋白质分子凝聚程度提高。这一现象进一步为谷蛋白的溶解性、乳化性、持水性和持油性等功能特性的变化提供了依据。

大米清蛋白二级结构以β-折叠为主,占41.49%。β-折叠所占比例随压力升高而降低,在400 MPa时达到最小值35.30%,随后极显著增加(p<0.01)。无规则卷曲含量变化与谷蛋白相似,在400 Mpa时达到最大值19.21%。200 MPa时α-螺旋含量极显著下降(p<0.01),且达到最小值8.85%,400 MPa时极显著上升(p<0.01),600 MPa时极显著下降(p<0.01)。β-转角含量在200 MPa和400 MPa时均极显著增加(p<0.01),200 MPa时达到最大值37.08%,但随着压力升高增长幅度变小,600 MPa时含量无显著变化(p>0.05)。

大米球蛋白二级结构以β-折叠为主,超高压处理后β-折叠的变化与清蛋白相似。3种压力处理下无规则卷曲含量均极显进一步比较三种蛋白质结构变化发现,超高压处理降低了三种蛋白质二级结构组成的有序结构(β-折叠和α-螺旋)的总量,这表明超高压处理破坏了清蛋白、球蛋白和谷蛋白的内部结构。

表2 超高压与大米谷蛋白功能特性及蛋白质结构之间的相关性

注:*显著相关(p<0.05);**极显著相关(p<0.01)。著升高,600 MPa时达到最大值17.07%。α-螺旋的含量在200 MPa和600 MPa处理时均极显著下降(p<0.01),400 MPa时无显著变化(p>0.05)。β-转角的含量变化与谷蛋白相似,在200 MPa时达到最大值43.87%。另外,超高压处理后β-转角取代β-折叠成为球蛋白主要结构。

由表2可知,压力与α-螺旋和持水性呈极显著负相关(p<0.01)。无规则卷曲与β-折叠呈显著负相关(p<0.05),和α-螺旋呈极显著负相关(p<0.01),说明超高压可以降低蛋白质有序结构含量,且有序结构向无序结构转变。蛋白质溶解性与β-折叠和α-螺旋呈极显著负相关(p<0.01),与无规则卷曲呈极显著正相关(p<0.01),乳化性与β-折叠呈极显著负相关(p<0.01),说明蛋白质有序结构减少,无序结构增加,蛋白质结构松散,有利于蛋白质溶解性和乳化性的提高。蛋白质溶解性与乳化性呈显著正相关(p<0.05),说明蛋白质乳化性能的优劣与其溶解性有关。蛋白质持油性与β-折叠呈显著正相关(p<0.05),和β-转角呈极显著负相关(p<0.01)。

3 结论

在超高压处理大米过程中,蛋白质的持水性和乳化性在200 MPa处理下提高,之后随压力增加而逐渐降低。谷蛋白溶解性随压力的增加先升高后降低。持油性在200 MPa处理下降低,之后随压力的增加先升高后下降。大米中的清蛋白、球蛋白和谷蛋白的二级结构均以β-折叠为主,超高压处理使这三种蛋白的β-折叠结构含量降低,有序结构总量减小,无序结构增多,蛋白质内部结构发生变化。相关性分析结果表明超高压可以使蛋白质有序结构减少。蛋白质有序结构向无序结构转变,使蛋白质结构松散,有利于蛋白质溶解性和乳化性的提高。另外,蛋白质乳化性能的其溶解性有关。

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Effects of ultra high pressure treatment on functional properties and structure of rice proteins

GUAN Yi-xian1,HE Miao1,XIONG Shuang-li1,2,*

(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China；2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010,China)

The objective of the study was to investigate the the effects of ultra high pressure treatment on the functional properties of glutenin and the structure of albumin,globulin and glutenin of rice. Result:ultra high pressure treatment changed the functional properties and the secondary structure of rice proteins,and different pressures had different effects. Solubility,water holding capacity and emulsifying ability of the glutenin increased and the oil holding capacity decreased after the 200 MPa pressure treatment.When pressure changed to 400 MPa,the water holding capacity and emulsifying ability decreased,the oil holding capacity increased,and there was no significant increase in the solubility. The solubility,water holding capacity,oil holding capacity and emulsifying ability decreased after the 600 MPa pressure treatment. Ultra high pressure treatment changed the secondary structure of albumin,globulin and glutenin which resulted in the reduction ofβ-sheet,and increase of disordered structure..Correlation analysis showed that there was close relationship among pressure,functional properties and secondary structure.

ultra high pressure,structure,functional properties,correlation analysis

2016-03-23

管弋铦(1991-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品化学及应用， E-mail:125446503@qq.com。

*通讯作者:熊双丽(1977-)，女，教授，研究方向：功能性食品加工与安全,E-mail:372364129@qq.com。

四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心专职科研创新团队建设基金项目(14tdgc04)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000