基于BP神经网络的牡蛎抗氧化活性肽制备工艺优化

刘盟梦,李银平,延海莹,张高丽,王 鹏

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266100)



基于BP神经网络的牡蛎抗氧化活性肽制备工艺优化

刘盟梦,李银平,延海莹,张高丽,王 鹏

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266100)

以牡蛎为原料,通过响应面和BP神经网络模型对牡蛎蛋白酶解过程、工艺条件进行优化研究,实现酶解过程中可控制备牡蛎抗氧化活性肽。结果表明:采用胰酶水解牡蛎,经响应面优化得到最佳酶解条件为:加酶量0.28%,温度55 ℃,时间3.4 h,此条件下酶解产物·OH清除率可达到78.4%。在此基础上,以酶解过程中的响应因子-游离谷氨酸含量来监控牡蛎蛋白水解过程,运用BP神经网络数学模型拟合蛋白水解过程与产物活性之间的关系。构建出以加酶量、料水比和酶解体系游离谷氨酸浓度为神经网络输入,酶解产物·OH清除率为输出的BP神经网络模型,以实现在预期时间内通过实时监测游离谷氨酸含量即可得出产物活性变化情况,并定点终止反应的目的。模型预测值与实验值相关性系数r为0.9943,平均相对误差值为2.1%。该模型拟合性能良好,与牡蛎蛋白酶解过程具有高度相关性,可应用于牡蛎抗氧化活性肽的在线监控与可控制备。

牡蛎,抗氧化活性肽,BP神经网络

牡蛎蛋白水解物生物利用价值高,其水解产生的抗氧化活性肽能够有效清除体内过剩的活性氧自由基,进而能够保护细胞和线粒体的正常结构和功能[1-3]。因此,在预防治疗自由基诱发的疾病和抗衰老方面有着广阔的应用前景[4-5]。

在酶解制备抗氧化活性肽的过程中,底物的水解过程十分复杂。底物水解的预处理条件、反应体系的pH及温度等因素都会影响酶促反应,进而使得酶解产物与预期有偏差,从而导致水解反应的控制十分困难[6]。在酶解过程中,通常使用蛋白水解度作为酶解产物水解程度的指标,然而该方法不能及时反映水解情况,无法达到在线控制水解的效果。牡蛎蛋白在水解过程中,肽链被逐渐切断,游离谷氨酸的产生量显著增加,利用生物传感器可快速、准确、稳定的测定游离谷氨酸含量。因此通过测定游离谷氨酸的含量变化可以“在线”直接或间接反映出蛋白的水解情况。

牡蛎蛋白的酶解与其产物活性之间存在非常复杂的非线性关系,但是简单的酶解动力学模型无法模拟酶解过程以及实现可视化的酶解控制。人工神经网络模型是模拟人脑生物过程的人工智能技术之一。在研究非线性问题、探索和研究复杂系统关系时,其以高度的并行性、良好的容错性,在处理非线性系统的工艺优化、过程模拟应用非常广泛[7-9]。

本实验以牡蛎为原料,采用生物酶法制备具有·OH清除活性的抗氧化活性肽,应用生物传感器检测响应因子(游离谷氨酸含量)变化,并结合人工神经网络技术拟合牡蛎蛋白酶解与产物·OH清除活性之间的非线性关系,进而实现酶法水解过程的可视化及抗氧化活性肽的可控制备。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牡蛎 2014年12月购于山东威海市乳山;胰酶(80000 U/g)、中性蛋白酶(230000 U/g)、碱性蛋白酶(200000 U/g)、动物蛋白水解酶(120000 U/g) 广西南宁庞博生物工程有限公司。

SBC-40C型生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所;HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;722N型可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;FD-1D-50型冷冻干燥机 北京博医实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解工艺流程 将牡蛎去壳洗净、匀浆,按料水比1∶2加入双蒸水,调节体系至酶的最适pH(其中胰酶和动物蛋白酶的最适pH为8.5,中性蛋白酶的最适pH为6.5,碱性蛋白酶的最适pH为10),再将所有体系预热至酶的最适温度(胰酶的最适温度为50 ℃,动物蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的最适温度为55 ℃),并按0.1%～0.3%加入不同种类的蛋白酶,以不加酶的实验组做为空白对照,在0、0.5、1.0、2.0、3.0 h分别取适量酶解液于沸水浴10 min终止反应,4000 r/min离心10 min取上清液,测定酶解产物的水解度和·OH清除率[10]。

1.2.2 水解度测定 参照檀志芬等[11]蛋白水解度测定方法(三氯乙酸溶解指数法),使用10%三氯乙酸沉淀牡蛎大分子蛋白。三氯乙酸溶解指数可以反应蛋白质的水解情况,溶解指数越高,表明较短肽段含量越高,水解度越高。

水解度(%)=mi/m0×100

其中,mi为10%三氯乙酸沉淀酶解液后的蛋白质量,m0为酶解液中的总蛋白质量。

I(%)=[A0-(Ai-Ai0)]/A0×100

其中,A0为双蒸水代替酶解液的反应体系测得的吸收值,Ai为酶解液在反应体系的吸收值。

1.2.4 响应面实验设计 利用Design Export软件,根据Box-Behnken实验设计原理以及预实验结果,以加酶量、温度、时间为自变量,活性肽·OH清除率为响应值设计的3因素3水平响应面[13],考察酶解牡蛎蛋白的最佳工艺条件,此时的料水比为1∶2。表1为实验因素水平编码。

表1 响应面因素设计水平

1.2.5 神经网络设计 实际生产过程中,反应体系的微小变化都会对酶解效果产生一定的影响,从而导致在预期时间内得到的产物活性达不到理想值。在优化酶解时间等工艺条件的基础上,对整个酶解过程进行可视化研究,通过生物传感器在线快速测定酶解反应中游离谷氨酸含量结合加酶量、料水比作为神经网络的输入建立模型,预测酶解产物·OH清除活性的变化,并验证模型预测性能。通过参考相关文献并比较神经网络训练效果与训练时间,构建含3个输入单元的输入层,3个神经元的隐含层和1个输出单元的输出层的BP神经网络[14]。以反应体系游离谷氨酸含量、初始酶浓度和初始底物浓度作为神经网络输入单元,以活性肽的·OH清除率作为神经网络的输出单元[13]。利用均匀设计和正交设计的思想,在0.1%≤加酶量≤0.4%,1∶4≤料水比≤1∶3范围内设计神经网络实验,网络结构如图1所示:

图1 BP神经网络结构示意图Fig.1 The structure of BP neural network

由于神经网络模型输入输出矢量单位的不统一,为了加快训练网络的收敛性,减小网络收敛误差,更利于数据处理,数据在输入前先作归一化预处理。归一化处理可以采用如下公式:Xi=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)[13]

X为训练样本的输入和输出数据,Xi为归一化后的数据,Xmax与Xmin是输入数据和输出数据的最大值、最小值。归一化处理后,48组输入输出矢量如下所示:

输入数据=-1 0000-1 0000-1 0000-1 0000-0 3333-0 3333-0 3333-0 33330 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 0000-1 0000-0 22220 14810 2593-1 0000-0 8148-0 2963-0 0741-0 33330 3333-0 33330 33330 33330 33330 33330 33330 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 03700 18520 4444-1 0000-0 77780 25930 29630 59261 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00001 0000-1 0000-0 3704-0 14810 11110 40740 66670 6296-0 25931 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00001 00000 03700 22220 6296-0 25930 03700 22220 62960 70371 00001 00000 33330 33330 33330 33330 33330 33331 00001 00000 00000 00000 00000 00000 00000 00001 00000 9630-1 0000-0 5926-0 03700 11110 25930 48150 3333-0 0667-0 0667-0 0667-0 0667-0 0667-0 3333-0 33330 0000-0 6000-0 6000-0 6000-0 6000-0 6000-1 0000-1 00000 5556-0 9259-0 7037-0 3704-0 2593-0 1852-0 9259-0 8519-0 3333-0 3333-0 3333-0 33331 00001 00001 00001 0000-0 2593-0 0741-0 0741-0 0741

1.3 数据统计分析

所得数据均通过三次平行实验得到,用Microsoft Excel 2007计算平行实验之间的标准偏差,使用Design Expert 8.0软件进行响应面实验分析,利用Matlab(R2012a)建立BP神经网络模型,通过调试训练函数,隐含层神经元个数等优化网络结构,并进行数据处理分析和作图。

2 结果与讨论

2.1 不同酶制剂对牡蛎蛋白水解效果的比较

蛋白酶对底物有一定的作用特异性,主要表现在作用的肽键不同[15]。不同蛋白酶作用下牡蛎的水解度及活性变化曲线如图2、图3所示。

图2 不同蛋白酶处理过程酶解产物水解度的变化曲线Fig.2 Effects of different enzymes on the hydrolysis degree of oyster

图3 不同蛋白酶处理过程中酶解产物·OH清除活性的变化曲线Fig.3 Effects of different enzymes on the ·OH clearance rate of enzymatic hydrolysate

由图2和图3可知,随着酶解时间的增加,酶解产物·OH清除活性和蛋白水解度均出现不同程度的上升且均显著高于空白对照(p<0.01)。四种酶的水解产物活性曲线均呈现先上升后期变化相对平缓的趋势,其中胰酶水解得到的产物·OH清除活性显著高于(p<0.05)其它蛋白酶。此外,酶解过程中,胰酶对牡蛎蛋白的水解度始终高于其它蛋白酶组。因此,选择胰酶作为制备牡蛎抗氧化活性肽的最适酶制剂。

2.2 响应面优化实验结果

2.2.1 响应面分析方案、实验结果及方差分析 对表2中的实验结果进行回归分析,得到活性肽·OH清除率(I)对加酶量(A)、温度(B)和时间(C)的三元二次回归方程:

I=78.17-1.00A-1.47B+5.38C+2.02AB+3.74AC+1.80BC-4.53A2-6.33B2-4.02C2

对回归方程进行方差分析和显著性检验,回归项p=0.0007,说明所选择模型显著,表明该二次回归模型能够显著拟合加酶量、温度和时间对活性肽·OH清除率的影响,该模型能够代替实验真实点对实验结果进行分析。方差分析结果表明:交互项AC对活性肽·OH清除率具有显著影响,一次项C、二次项A2、B2、C2具有极显著影响。因素的F值可以反映出各因素对实验指标的重要性,F值越大,表明对实验指标的影响越大,即重要性越大。通过比较三个因素的F值可知:各因素对活性肽·OH清除率的影响程度大小顺序为:时间(C)>温度(B)>加酶量(A)。

2.2.2 响应面分析 利用Design-Expert软件对表2的实验数据进行三元二次回归拟合分析,所得响应面如图4～图6所示,各因素及其交互作用对活性肽·OH清除率的影响结果可直观地反映出来。

响应面图显示了其中一个因素位于中心水平时,其余两个因素的交互作用对活性肽·OH清除率的影响。坐标面上等高线的形状可以反映两因素间交互作用的强弱,圆形表示两因素间交互作用较弱,椭圆形则表示交互作用较强[16-17]。由图5可知,相对于其他因素的交互作用来说,时间和加酶量的交互作用对活性肽的·OH清除率具有较明显影响。

表2 Box-Behnken实验设计及结果

图4 加酶量和温度对活性肽·OH清除率的响应曲面图Fig.4 Response surface of the enzyme concentration and temperature on the yield of hydrolysate ·OH clearance rate

图5 酶解时间和加酶量对活性肽·OH清除率的影响相应曲面Fig.5 Response surface of the hydrolysis time and enzyme concentration on the yield of hydrolysate ·OH clearance rate

图6 酶解时间和温度对活性肽·OH清除率的影响相应曲面Fig.6 Response surface of the hydrolysis time and temperature on the yield of hydrolysate ·OH clearance rate

通过响应面实验得到酶解牡蛎蛋白制备·OH清除抗氧化活性肽的最佳工艺条件为:温度55.4 ℃,时间3.4 h,加酶量0.28%。此条件下·OH清除率的预测值为80.1%。为验证所得最优参数的可靠性,结合实际的可操作性,在55 ℃、加酶量0.28%条件下酶解3.4 h,产物·OH清除率为78.4%,与预测值的误差为2.1%,说明采用响应面优化得到的酶解条件可靠。

2.3 神经网络建模结果

通过响应面实验优化酶解牡蛎蛋白条件,获得了具有较高·OH清除活性的目标产物。为了克服酶解反应过程中搅拌速度、pH变化等因素所导致的酶解时间与预期产物活性的不一致性,采用胰酶进行水解,以游离谷氨酸实时的产生量作为水解程度指标,并作为BP神经网络的输入建立模型,拟合出酶解体系中游离谷氨酸的产生量与产物·OH清除活性之间的关系,实现在反应过程中在线监测产物的活性变化以及在预期的时间范围内定点终止酶解反应。

本研究通过采用Matlab(R2012a)软件,对酶解过程建立一个三层结构的BP神经网络,以加酶量、料水比和酶解体系游离谷氨酸浓度为神经网络输入单元,以活性肽·OH清除率为输出单元,选择正切S型传递函数“tansig”函数为隐含层传递函数,网络训练函数采用“trainlm”。

2.4 神经网络模型拟合酶解过程结果

通过对实验数据进行训练,建立输入数据和输出数据之间复杂的非线性关系。软件Matlab(R2012a)训练结果如下:

表3 网络的预测值与实验值的比较

由图7可知,该BP神经网络模型经过23步训练后网络性能即达到所设定的均方误差目标要求,并趋于稳定。图8显示了模型的网络输出值与目标值之间的回归分析,模型决定系数R2值达到了0.9883,拟合曲线与目标曲线基本重合,输出结果和目标结果得到较好的线性回归效果,模型建立成功,可用于后续预测。图9是实验值与BP神经网络预测值的相关性比较分析图。将原始数据在该训练后的网络下进行仿真,独立样本检验结果显示两组数据无显著性差异。两组数据的相关性系数r为0.9943,拟合平均相对误差值为2.1%,表明BP神经网络预测值与实验数值之间具有一致性。对于整个复杂的水解过程,通过该BP神经网络模型仿真得到的预测值实现了对原始样本值的较好的拟合。

图7 神经网络数据训练图Fig.7 ANN data training plot

图8 神经网络回归模型相关性Fig.8 ANN regression model correlation

图9 实验值和预测值相关性图Fig.9 The correlation of actual values and the predicted values

2.5 神经网络的预测性能

随机在0.1%≤加酶量≤0.4%,1∶4≤料水比≤1∶3范围内进行5组独立实验,测定反应过程中游离谷氨酸含量并使用训练好的神经网络计算酶解产物·OH清除率,将其与实际·OH清除率进行比较,结果如下:

由表3可知,利用模型进行5次随机验证实验,实验值与预测值的相对误差在0.2%～4.2%范围内,表明所建立的BP神经网络模型预测性能良好,具有较高的精确度。

通过响应面实验优化的酶解条件如下:加酶量0.28%、温度55 ℃、酶解时间3.4 h,酶解产物·OH清除率为78.4%,此条件下体系中游离谷氨酸含量为75 mg/dL。在酶解2.9～3.9 h时间范围内通过生物传感器实时测定反应体系中游离谷氨酸含量来监测该水解反应过程中·OH清除活性的变化情况,当游离谷氨酸含量达到75 mg/dL时终止酶解反应,通过神经网络模型预测酶解产物·OH清除活性大小为76.7%,与实际值相差2.2%,表明该神经网络模型能在线准确的拟合出酶解过程中游离谷氨酸产生量与产物·OH清除率之间的关系,并能达到可控制备牡蛎抗氧化活性肽的目的。

3 结论

以牡蛎为原料,通过单因素实验得出水解牡蛎最佳用酶为胰酶,采用Box-Behnken响应面实验设计对酶解工艺进行优化,得到最佳酶解工艺条件为:加酶量0.28%,温度55 ℃,时间3.4 h。在此条件下酶解产物·OH清除率可达到78.4%。通过生物传感器在线测定反应体系中游离谷氨酸的含量,结合BP神经网络模型模拟出了牡蛎酶解程度与·OH清除活性之间的复杂关系。模型模拟效果良好,相关性系数r为0.9943,可以高度拟合各种酶解条件下游离谷氨酸含量和酶解产物活性变化情况之间的关系,实现了酶解过程的可视化和可控制备牡蛎抗氧化活性肽。

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Optimization of enzymatic processing for antioxidant peptides from oyster based on a BP neural network

LIU Meng-meng,LI Yin-ping,YAN Hai-ying,ZHANG Gao-li,WANG peng*

(College of Food Science and Engineering,Ocean university of China,Qingdao 266100,China)

In order to achieve the controllable preparation of antioxidant peptides from oyster,enzymatic hydrolysis conditions were optimized on the basis of the response surface methodology(RSM)and neural network models. In this study,pancreatin was used for the oyster hydrolysis. The results of RSM showed that the optimal hydrolysis condition was 0.28% pancreatin dosage,temperature of 55 ℃,and hydrolysis duration of 3.4 h,under this condition the ·OH clearance rate of its enzymatic prodcut reached 78.4%. The free glutamic acid concentration was used as the monitor of enzymatic hydrolysis process. The back propagation(BP)neural network model was applied to fit for the relationship between enzymatic hydrolysis process and activity of the hydrolysate. The correlation coefficient between predict value and confirmatory experiment were 0.9943,and the average relative error was 2.1%,which indicated that this BP neural network model showed good performance. It was an effective way to monitor the enzymatic hydrolysis on-line,and made it possible to realize controllable preparation of antioxidant peptides.

oyster;antioxidant peptides;BP neural network

2016-03-30

刘盟梦(1991-),男,硕士,研究方向:水产品加工与利用,liumengm_5262@qq.com。

*通讯作者:王鹏(1980-),男,副教授,研究方向:海洋应用微生物,pengwang@ouc.edu.cn。

山东省自然科学基金(ZR2015DQ005);山东省科技发展计划项目(2015GSF115038)。

TS

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000