JNK通路参与曲古抑菌素A诱导的胰腺癌PANC－1细胞凋亡

王本泉，张 玲，黄 雪，陈宗静，白永恒，吴存造，周蒙滔，陈必成，

（温州医科大学附属第一医院1.外科实验室，2.移植中心，浙江 温州 325000）

近年来研究显示，胰腺癌的发生和发展涉及多种基因突变和表观遗传学的变化［1－2］。组蛋白修饰是基因表达的一种表观遗传学调控方式，组蛋白的乙酰化状态在基因的表达调控中发挥非常重要的作用。组蛋白乙酰化状态受组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）共同调节［3］，组蛋白乙酰化状态的失衡可能导致肿瘤的发生，而HDAC抑制剂可明显抑制肿瘤的生长［4］。目前，已发现多种HDAC抑制剂，曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是其中具代表性的药物之一。TSA不仅具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化及化疗增敏作用，而且还可诱导细胞凋亡［5］。线粒体凋亡途径是TSA作用的机制之一［6］，还可能涉及细胞周期调控、血管生成和死亡受体等多种途径［7－8］。

c－Jun氨基端激酶（c－Jun N－ter minal kinase，JNK）又称应激活化蛋白激酶（stress－activated pr otein kinase，SAPK），作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）家族中的重要成员，JNK信号通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生发展中发挥调节作用，是细胞内重要的信号转导通路之一［9－14］。JNK活化可诱导细胞发生凋亡，多数研究认为JNK通路活化为化疗药物、紫外线照射等诱导细胞凋亡所必需［15－17］。JNK通路活化是否参与 TSA诱导的胰腺癌细胞凋亡过程尚不清楚。本研究通过观察JNK通路在TSA诱导PANC－1细胞凋亡中的作用，探讨TSA诱导胰腺癌细胞凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

TSA和Hoechst33258购自美国Sig ma公司，用二甲亚砜（DMSO，Sig ma）溶解至10μmol·L－1，使用前用无血清培养基稀释至工作浓度。JNK抑制剂（SP600125）购自上海碧云天生物技术有限公司。DMEM 培养基、胎牛血清、Trizol购自美国Gibco BRL公司。CCK－8试剂盒购自日本同仁化学研究所。逆转录试剂盒和SYBRGreenⅠ荧光定量试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，实时荧光定量PCR所用引物由英骏生物技术有限公司合成（表1）。兔抗人Bax，bcl－2和p－JNK一抗以及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔Ig G二抗购于英国Abcam生物公司，胱天蛋白酶3、活性胱天蛋白酶8及p－c－Jun抗体购自美国Cell Signaling公司。Varioskan酶标仪，美国Ther mo公司；ABI7500荧光PCR仪，美国应用生物系统公司；DM4000 M荧光显微镜，德国徕卡公司。

Tab.1 Primers used with real－time PCR

1.2 细胞培养及分组处理

胰腺癌PANC－1细胞用含10%胎牛血清、链霉素100 g·L－1、青霉素100 g·L－1的DMEM 培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养。取对数生长期的细胞，TSA 0.25，0.5，1和2μmol·L－1处理24 h后，检测细胞存活率，取1μmol·L－1浓度进行后续指标检测实验。对数生长期的细胞分3组，正常对照组，加入等量培养液共培养，TSA 1.0和TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20μmol·L－1组，处理24 h，Hoechst33258染色观察凋亡细胞，实时定量PCR方法检测凋亡相关及JNK通路相关基因的表达，Wester n印迹法检测凋亡相关及JNK通路相关蛋白的表达。

1.3 CCK－8法检测细胞存活率

收集对数生长期的PANC－1细胞制成单细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种到96孔板（每孔100μl），待细胞贴壁生长融合至80%时，TSA单独处理，细胞分4组，每组设4个复孔：TSA 0.25，0.5，1和2μmol·L－1。TSA＋SP600125联合处理细胞分3组，每组设4个复孔：TSA 1.0μmol·L－1，TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20和40μmol·L－1组。以不含TSA和SP600125的培养基处理细胞作为细胞对照组。药物作用24 h后，各孔加入10μl CCK－8，继续培养2 h，酶标仪测定吸光度（A450nm）值，计算细胞存活率。实验重复3次。细胞存活率（%）＝A实验组／A对照组×100%。

1.4 Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡

按照1.2分组处理的细胞作用24 h后，吸干培养基，用PBS洗2次，4%甲醛液固定10 min，双蒸水冲洗2次，吸干双蒸水后，Hoechst33258（5 mg·L－1）室温下振荡避光染色5 min，然后用双蒸水冲洗2次，室温下凉干后于荧光显微镜（激发波长360 n m，发射波长450 n m）下观察，并随机选取位置进行拍照。每组随机选取100倍镜下3个视野，分别计算每个视野细胞凋亡率（%）＝有凋亡小体的细胞数／细胞总数×100%。

1.5 实时定量PCR检测凋亡相关基因及JNK通路相关基因的表达

按照1.2分组处理的细胞作用24 h后，用Trizol试剂盒提取各组细胞的总RNA，每组吸取2μg RNA样本在10μl体系中进行逆转录反应，参照逆转录试剂盒说明书进行。取逆转录产物1μl进行PCR扩增，PCR扩增体系：5μl 2×SYBR Green荧光定量试剂、2μl引物（上、下游各1μl，终浓度200 n mol·L－1）、2μl反应缓冲液、1μl c DNA。扩增程序为：95℃10 min，95℃15 s，62℃10 s，40个循环。得到的Ct值用2－△△Ct法计算mRNA表达。检测靶基因包括肿瘤凋亡相关基因bcl－2和bax，JNK通路相关基因c－f os，c－Jun以及El k1。

1.6 Western蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白及JNK通路相关蛋白的表达

按照1.2分组处理的细胞作用24 h后，每5×106个细胞加100μl细胞裂解液作用20 min后用细胞刮收集细胞，7500×g离心10 min，收集上清液测蛋白浓度；制备12%聚丙烯酰胺分离胶和4%积层胶，样品5×SDS上样缓冲液，设置恒压200 V，电泳60 min；设置恒压100 V，湿法电转移60 min；转膜后的PVDF膜经5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭1 h；然后加一抗（稀释在5%脱脂奶粉TBST溶液中）4℃孵育过夜，加入相应种属二抗，室温孵育1 h，加入ECL发光液孵育膜5 min，暗室压片曝光，显影定影后胶片保存。运用Quantity one软件分析各个条带的积分吸光度（integrated absor bance，IA）值，目的蛋白的IA值与相应内参蛋白的IA值的比值表示待测蛋白的相对表达水平。分别检测凋亡相关蛋白Bax，活性胱天蛋白酶8，bcl－2和胱天蛋白酶3蛋白的表达。

同样按照上述方法，检测TSA 1.0μmol·L－1处理0，1，2，4和6 h，p－JNK和p－c－Jun蛋白的表达。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 TSA对PANC－1细胞存活率的影响

CCK－8法分析结果显示，TSA 0.25～2μmol·L－1单独处理，PANC－1细胞的存活率随着TSA浓度的增加而降低，显示TSA对细胞存活的抑制作用具有一定的量效关系（r＝0.9564，P＜0.05）（图1）。若加入SP600125 20 和 40μmol·L－1，PANC－1细胞的存活率较TSA单独处理明显增加（P＜0.05），并且SP600125 40μmol·L－1组明显高于20μmol·L－1组（P＜0.05）（表2）。

Fig.1 Effect of trichostatin A （TSA）on PANC－1 cell viability by CCK－8 method.Cells were treated wit h TSA for 24 h.±s，n＝3.＊P＜0.05，compared with 0.5μmol·L－1 group；＃P＜0.05，compared with TSA 1μmol·L－1 group.

Tab.2 Effect of SP600125 on TSA induced cell viability

2.2 TSA对PANC－1细胞凋亡的影响

Hoechst33258染色发现，正常对照组细胞，凋亡率为（1.8±0.4）%（图2 A），TSA 1μmol·L－1组可见细胞核形态明显异常，可见多个凋亡小体样结构（图 2B），凋亡率为（6.2±4.1）%；TSA＋SP600125组仍可见凋亡细胞，但凋亡率明显下降，为（3.9±0.9）%（图2C）（n＝3，P＜0.05）。

Fig.2 Effect of TSA on PANC－1 cell apoptosis（Hoechst33258 staining×400）.See Fig.1 f or t he legend.A：nor mal control group；B：TSA 1μmol·L－1 gr oup；C：TSA＋SP600125 20μmol·L－1 gr oup.Arro ws sho w t he apoptotic body－like str uct ures.

2.3 TSA对PANC－1细胞凋亡相关基因及JNK通路相关基因表达的影响

实时定量RT－PCR分析结果显示，与正常对照组相比，TSA 1.0μmol·L－1作用PANC－1细胞24 h后，凋亡相关基因bax mRNA表达明显升高（P＜0.01），bcl－2 mRNA明显降低（P＜0.01），JNK通路相关基因c－Jun，c－f os和El k1 mRNA明显升高（P＜0.01）。与 TSA 组相比，TSA＋SP600125组bax mRNA表达明显降低（P＜0.01），bcl－2 mRNA明显升高（P＜0.01），c－Jun和c－fos表达明显降低（P＜0.01），而El k1 mRNA表达亦降低，但无统计学意义（表3）。

Tab.3 Effect of TSA on mRNA expression of bax，bcl－2，c－Jun，c－fos and Elk1 by real ti me RT－PCR

2.4 TSA对PANC－1细胞蛋白表达的影响

TSA 1.0μmol·L－1作用PANC－1细胞1 h后，p－c－Jun和 p－JNK 明显激活，2 h达峰值（图 3 A1，A2）。与正常对照组比较，TSA组促凋亡蛋白Bax和活性胱天蛋白酶8的表达明显升高（P＜0.05）（图3B1，B2），抗凋亡蛋白bcl－2和胱天蛋白酶3（全长片段）（图3C1，C2）的表达明显降低（P＜0.05）。与TSA组比较，TSA＋SP600125组的Bax和活性胱天蛋白酶8（图3B1，B2）的表达明显降低（P＜0.05），bcl－2和胱天蛋白酶3的表达明显升高（P＜0.05）。说明SP600125对TSA诱导的凋亡相关蛋白有一定的影响。

Fig.3 Effect of TSA on p－JNK and p－c－Jun protein（A），Bax and activated caspase 8（B），and bcl－2 and caspase 3 proteins（C）by Wester n blotting.A2，B2 and C3 were t he se miquantitative results of A1，B1 and C1，respectively.A.Lanes 1－5：TSA for 0，1，2，4，and 6 h，respectively.B and C.Lane 1：nor mal control gr oup；lane 2：TSA 1.0μmol·L－1 for 24 h gr oup；lane 3：TSA 1.0μmol·L－1＋SP600125 20μmol·L－1 f or 24 h，respectively.±s，n＝3.＊P＜0.05，co mpared wit h 0 h group；＃P＜0.05，co mpared wit h nor mal contr ol gr oup；△P＜0.05，co mpared wit h TSA group.

3 讨论

胰腺癌对化疗药物不敏感，发展新型化疗药物和化疗增敏药物是改善胰腺癌治疗效果的方法之一。HDAC抑制剂可明显抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡［4］。由于大多数肿瘤细胞呈高度乙酰化状态［8］，因此具有抑制HDAC活性的药物已成为抗癌治疗的新策略。本研究通过体外实验证明，TSA可抑制胰腺癌细胞增殖，诱导胰腺癌细胞凋亡，JNK通路参与了TSA诱导细胞凋亡的过程。

TSA因高效、低毒而在肿瘤治疗中受到关注［18－20］。目前已有文献报道，TSA 可通过诱导P53依赖的途径［21］和死亡受体途径［8］诱发胱天蛋白酶级联反应［22］，抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡。刘维民等［23］研究结果显示，TSA作用于人肝癌细胞SMMC－7721后，可增加抑癌基因p53、促凋亡基因bax的表达；汪理等［24］的研究提示，TSA诱导胰腺癌细胞的凋亡可能与其下调抗凋亡基因bcl－2表达有关。我们前期的研究亦证实，TSA可明显抑制PANC－1细胞生长，诱导细胞发生凋亡，且此效应与TSA作用的浓度和时间成正相关［6］。此外，我们还证实在细胞凋亡的过程中，线粒体通路激活，即bax蛋白表达升高，bcl－2蛋白表达降低，进而可能引发胱天蛋白酶级联反应，导致细胞发生凋亡。

JNK通路参与凋亡过程，已有报道认为JNK通路激活可促进细胞凋亡，但是JNK通路激活却抑制细胞凋亡亦有报道。目前，研究认为JNK介导细胞凋亡的机制主要包括：① 转录因子途径，即通过调控相关转录因子的转录，促进p53，Bax，Fasl和TNF等促凋亡蛋白的表达而介导死亡受体途径和线粒体途径的细胞凋亡［25］。JNK一旦被激活，磷酸化的JNK即发生核转位，激活转录因子c－Jun和Elk－1等，还可诱导BH3－only蛋白（Bid，Bad和Egl1）的表达，随后活化Bax等促凋亡蛋白，后者作用于线粒体，促使细胞色素c释放入胞浆，细胞色素c和胱天蛋白酶9结合，最终作用于胱天蛋白酶3，激活的胱天蛋白酶3与凋亡底物结合引起细胞凋亡［15，26－29］。② 非转录因子途径，在JNK活化过程中，部分活化的JNK滞留于细胞质，它们可直接作用于Bcl－2家族，调控该家族蛋白的活性，从而介导线粒体途径的细胞凋亡，此过程没有新基因的表达。

为了验证JNK通路在TSA诱导细胞凋亡中的作用，本研究通过加入JNK抑制剂SP600125阻断JNK通路。实验结果表明，TSA＋SP600125联合组的细胞存活率明显高于TSA单独处理组，JNK通路抑制剂明显降低TSA诱导PANC－1细胞的凋亡效应。TSA作用PANC－1细胞1 h后，JNK信号通路明显激活，2 h达峰值，表明JNK信号通路可能参与TSA抗肿瘤的机制。高浓度TSA作用24 h后，JNK通路相关基因的表达均较对照组增高。PANC－1细胞bax mRNA，bax蛋白、活性胱天蛋白酶8的表达明显升高，bcl－2 mRNA和bcl－2蛋白的表达明显降低，推测TSA可能激活了线粒体凋亡程序，Bax／bcl－2失平衡而导致细胞死亡。阻断JNK信号通路后，JNK通路相关基因的表达则降低，线粒体凋亡途径受到抑制，bax mRNA和Bax及活性胱天蛋白酶8蛋白的表达均降低，bcl－2 mRNA和bcl－2蛋白表达升高。亦有研究发现，在不同类型的细胞中，受不同类型的刺激，JNK通路活化不导致凋亡，而可能促进细胞增殖分化。其可能的解释为，人体内可能存在多种JNK的同工酶，在不同的细胞中，或处于细胞发育的不同阶段，它们的表达水平不同，对刺激的反应方式亦存在差异。TSA在其他类型的肿瘤细胞中是否依赖JNK通路发挥促凋亡作用尚需要进一步深入研究。

总之，本研究结果表明，TSA可抑制PANC－1细胞增殖，诱导其凋亡，JNK通路可能参与此过程。

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