RT-PCR 方法检测儿童细菌感染

Chiara Azzari 教授

姚开虎 副研究员

姚开虎副研究员 非常高兴邀请到意大利佛罗伦萨大学附属Anna Meyer儿童医院Chiara Azzari教授来北京儿童医院做学术访问，在您的“侵袭性细菌感染的分子学诊断:一个有用的临床工具”的报告中谈到采用分子诊断方法评估意大利肺炎链球菌疾病负担的工作，这些经验对中国开展相关工作具有很好的借鉴意义。分子生物学方法有很多，各有优缺点。在北京儿童医院的有关研究项目中，使用多重PCR和核酸杂交的方法比较多。

Azzari教授 目前临床上细菌感染诊断能采用的最好的分子生物学方法还是RT-PCR，其特异度可达到100%，敏感度也很高。和细菌培养方法比较，敏感度可达98%，即100份培养阳性的标本用RT-PCR检测98%阳性;但100份RT-PCR阳性标本的培养阳性率只有50%，甚至更低。所以，认为“和培养方法比较，RT-PCR方法敏感度为98%”是不确切的，更为准确的说法是:RT-PCR方法远比培养方法敏感。

很多研究者认为细菌培养方法已经不适于作为标准方法，应该考虑使用RT-PCR作为诊断细菌感染的标准方法。美国CDC在世界各地指导实验室工作时均推荐使用RTPCR。

Anna Meyer儿童医院发表在PloS One的多中心研究表明，RT-PCR检测病毒和细菌较普通PCR更为敏感。此后，又与澳大利亚、加拿大、美国和欧洲的实验室进行了多中心盲法检测肺炎链球菌血清型的比较研究，澳大利亚的实验室准备了不同数量的主要和次要血清型的肺炎链球菌标本，其他实验室或选择细菌培养方法，或选择普通PCR方法，我们实验室选择了RT-PCR方法对样本直接检测，敏感度之高让澳大利亚实验室难以置信，要求再进行RT-PCR、培养+RT-PCR同时检测，结果RT-PCR对主要血清型肺炎链球菌检测的敏感度达到100%，但对次要血清型检测的敏感度稍低一些，培养+RT-PCR的敏感度不论对主要还是次要血清型都接近100%。RT-PCR对次要血清型检测的敏感度较低可能与没有检测所有已知的血清型有关，但就常规检测来说已经足够。

姚开虎副研究员 细菌感染的其他实验室检测方法的结果如何?

Azzari教授 培养+基因芯片的检测方法也取得了很好的结果。基因芯片从标本中直接检测的结果对肺炎链球菌主要血清型检测的敏感度尚可，但对次要血清型的检测阳性率很低(约20%)。因为当时基因芯片方法检测血清型要基于细菌培养结果，如果培养结果阴性，基因芯片方法的结果也比较差。

姚开虎副研究员 北京儿童医院对呼吸道标本采用多重PCR结合反向线点杂交方法(mPCR/RLB)，敏感度和特异度都很高。针对死亡病例肺组织标本，原位 PCR(IS-PCR)和核酸杂交的检测阳性率水平接近。通过实时荧光定量PCR鉴定细菌时，由于定量PCR扩增的循环数与结果的判断关系很大，在Anna Meyer儿童医院实验室区分阴性和阳性结果选择的合适循环数是多少?

Azzari教授 我们根据多次实验结果总结出在40个循环比较合适。

姚开虎副研究员 PCR方法阳性率都很高，短期内控制检测质量较为容易，但长期控制实验质量比较困难。在长期研究中发现，更换检测试剂产品、产品批次和重新合成引物等都有可能影响到实验结果。有时候很难确定问题出在哪些环节，需要再次使用阳性标本等反复试验。获得一个稳定的检测体系和方案，常需提前安排一些质量控制工作，以保证检测结果准确可靠。

Azzari教授 试剂更换过程中，较容易出现问题的是引物，必须经常使用阳性对照检测引物，每1～2个月就应该对检测的所有血清型做阳性对照检测，以确认引物有效，这个工作非常重要。针对肺炎链球菌要同时检测自溶酶基因lytA，如果lytA阳性说明有肺炎链球菌感染，而如果血清型的检测均为阴性，说明检测血清型的引物可能有问题，或者是其他少见或新的血清型，需要增加特异引物。遇到这样的结果，可能需要考虑对荚膜位点基因进行测序，从序列信息很容易确定血清型，但价格昂贵不能常规开展。

姚开虎副研究员 RT-PCR检测时间也比细菌培养方法缩短，临床能及时得到回馈信息，有利于医生及时修订治疗方案。对于细菌耐药严重情况，及时反馈的信息对控制抗生素使用非常有好处。

Azzari教授 在意大利，明确脑膜炎病原是肺炎链球菌后，会选用头孢噻肟或头孢噻肟+万古霉素治疗，或者万古霉素治疗后不见好转再加用头孢噻肟。如果脑膜炎的病原中检测到脑膜炎双球菌，青霉素和磺胺类药物均有效，只需要选用一种即可。这些都对控制抗生素耐药有积极意义。从公共健康角度意义更重大，如明确是b型流感嗜血杆菌(Hib)或脑膜炎双球菌的感染，就应开始对接触者行预防性治疗。明确本地区现在肺炎链球菌感染的血清型就可以考虑针对性使用疫苗，19A型在意大利已经相当流行，7价、10价疫苗都不适用，应该选用包含19A型的13价结合疫苗。

姚开虎副研究员 中国的研究结果也显示在华北(北京、天津)和东北(沈阳)的一些城市肺炎链球菌19A型已经流行，甚至是第一常见的血清型，也应该考虑使用13价结合疫苗。

病原检测应该要求临床医生对送检标本、送检项目要有清楚的认识，不轻易的去做大范围的检测。

Azzari教授 这一点非常重要。RT-PCR受检测引物的决定，从临床角度来说检测所有细菌和病毒不现实。免疫缺陷患者怀疑HIV感染时，检测的应是HIV，不应包含HCV或者HBV。意大利化脓性脑膜炎90%的病原菌为肺炎链球菌、脑膜炎双球菌和流感嗜血杆菌，临床怀疑化脓性脑膜炎时应首先检测这3种病原菌，如果结果阴性再检测葡萄球菌等其他病原，这样能有效节约资源。再如肺炎链球菌和肺炎支原体是肺炎最常见的病原，如果医生发现病例有肺坏死的表现，考虑可能是少见的金黄色葡萄球菌感染，此时临床医生可以要求实验室对可检测的所有肺炎病原进行检测，但对脑膜炎球菌等病原仍然没有检测必要。对于病毒病原，思维程序也是相似的。

Anna Meyer儿童医院有一个病原检测分组(panels)的概念，检验科医生与临床医生共同讨论决定不同疾病的检测项目，如社区获得性肺炎和ICU肺炎的病原检测项目是不同的。ICU肺炎的病原中有肠球菌、大肠埃希菌等，但在社区获得性肺炎就不做上述细菌检测。不同病原检测仍为阴性时，会针对16S rDNA进行测序，该基因存在于所有细菌，因为不是很特异，这项工作不能采用RT-PCR。

临床医生应指导实验室确定检测的方向。百日咳杆菌不应该存在于咽喉部，如果检测结果阳性，就是异常。但很多病毒、细菌可以在咽喉部正常存在，也可能致病。咽喉部检测到肺炎链球菌，可能是肺炎病原，也可能就是寄生菌，不能以这个结果进行判断。小婴儿携带脑膜炎球菌的情况也很少见，如果在咽拭子中检测到奈瑟氏球菌，就应考虑流行性脑膜炎。重要的是临床医生要知道在什么部位能发现什么，不能发现什么，并根据临床情况确定采集标本的种类和检测病原方向。

姚开虎副研究员 采集标本的时机和方法都会影响检测结果。对于分子生物学方法检测，病原菌标本的采集您能给出一些什么建议。

Azzari教授 应尽可能早地采集标本，第一份标本中检出病原的可能性大。就RT-PCR检测，标本保存1～2d不会影响结果。最好采集无菌体液标本，如果发现病原就意味着该病原的感染。在无菌标本中没有发现病原，可以考虑使用拭子标本，但要明确目的是什么。比如咽拭子标本检测是否百日咳杆菌感染是可行的，要判断是否肺炎链球菌感染则不可行。临床医生遇到长期发热的患儿，想检测腺病毒感染，以区别川崎病，如果送检血标本检测出了腺病毒，可以肯定腺病毒感染;但如果是咽拭子标本，则不能肯定，因为腺病毒可以在感染后持续存在数月。

姚开虎副研究员 尽可能早的采集标本对细菌培养检测也很重要，但同时需要强调及时送检，放置过久对结果影响很大。常规培养常推荐在患儿发热时采集血标本，而mPCR/RLB检测的标本并没有提出这样的要求，但检测标本常常是在采集血培养时留取的标本，检测的敏感度和特异度还是相当高。

Azzari教授 发热时采集血标本对RT-PCR检测病原可能也是最好的时间点，但并没有发现采集标本时机对结果有明显影响。有一点必须考虑到，仅10%～15%的肺炎存在菌血症。

姚开虎副研究员 在呼吸道感染病原菌的检测中，假阳性的问题常被提及。已经证明肺炎链球菌很多特异的致病毒力因子基因，也存在于鼻咽部或口腔携带的缓症链球菌、口腔链球菌等菌株中。也有文献报道肺炎链球菌携带者尿抗原检测阳性。目前有研究证明在临床标本中检测某些基因，包括lytA、ply等可用于肺炎链球菌的诊断，多数研究结果显示其具有较高的敏感度和特异度。

Azzari教授 要确认从血标本中检测出肺炎链球菌NA意味着感染，而不是携带。肺炎链球菌携带者尿抗原检测阳性率为50%，这个结果像是掷硬币。Anna Meyer儿童医院不采用尿抗原检测方法。但是血标本的检测结果有所不同，J Med Microbiol在2011年发表的一项研究结果显示，肺炎链球菌的携带者血标本中肺炎链球菌RT-PCR检测不会呈阳性;如阳性就意味着肺炎链球菌感染。这篇文章刊出后2个月，美国CDC发表在Diagn Microbiol Infect is上研究也证实了这一结论。这2项研究很好的说明了T-PCR方法的特异度。这一结论不同于1998年发表在Clin Microbiol一项研究的结论，其认为肺炎患者和健康对照者或携带和非携带肺炎链球菌者均可能出现阳性结果。出现差异性的结论源于1998年的研究，采用的是普通CR，特异度比较差，检测的是肺炎链球菌溶血素基因ply，而非当前检测的lytA。

姚开虎副研究员 您是否认为采用RT-PCR检测方法在诊断肺炎链球菌感染及其血清型方面非常优秀?

Azzari教授 是的，采用RT-PCR检测方法得到的肺炎链球菌阳性结果是不用怀疑的。

姚开虎副研究员 临床很关注细菌耐药。细菌感染使用抗生素，药物敏感性的检测具有重要的指导价值，但是细菌培养阳性率很低。您对目前分子生物学方法检测耐药基因、耐药突变位点的研究如何评价。

Azzari教授 分子生物学方法来检测细菌耐药性与细菌培养药物敏感性检测结果之间并非一致，有条件应进行药物敏感性检测。在Anna Meyer儿童医院同时留取2份标本，一份标本送培养，一份行RT-PCR检测。RT-PCR给出阳性结果时，如果培养也阳性，就可以进行药物敏感性检测;如果培养阴性，会行耐药性的分子生物学检测。Anna Meyer儿童医院的医生不愿意送检胸腔积液进行细菌培养，因为从来没有得到过阳性结果，实际上可以停止这样的检查。但对脑脊液来说，还是可以进行细菌培养，还是会有阳性结果发现，这些阳性结果可以很好的用于评估药物敏感性。

姚开虎副研究员 意大利细菌耐药的情况如何?

Azzari教授 肺炎链球菌耐药并不常见，主要是对大环内酯类抗生素耐药，红霉素耐药率大约40%。

姚开虎副研究员 来自中国的研究普遍认为，中国肺炎链球菌红霉素耐药率接近100%。

Azzari教授 在意大利，几乎没有对青霉素，尤其是对头孢菌素耐药的肺炎链球菌。发热的儿童，在家从来不立即使用抗生素。使用抗生素前，至少观察3～4d，如果4d后仍然发热，病情较重，会考虑使用抗生素。如果有证据显示是病毒感染，即使较长时间发热也不会使用抗生素。

姚开虎副研究员 中国正在推行行政干预的严格控制临床抗生素使用的规定，意大利是否也有相应的规定?

Azzari教授 有，但并不是通过政府行政干预，而是通过科学组织制定的临床指南。

姚开虎副研究员 是否使用一种药物，是一个医学科学问题。滥用抗生素问题应该通过科学教育和引导来解决。在建议、指南和规范都没有见到任何效果的情况下，由行政干预来修正和指导，临床医生应该好好反省。

指南不能改变抗生素滥用的一个原因是医生对自己的医疗行为(处方抗生素)可能引起的公共卫生后果(细菌耐药、耐药菌感染和后抗生素时代)不太关心。

中国药物和疫苗的管理是两个不同系统，儿科医生并不能开疫苗处方。绝大多数疫苗又都用于儿童，儿科医生理应对此予以关注。但实际情况是中国儿科医生对此类公共卫生问题缺少系统认识，行动更少。

Azzari教授 每个儿科医生应当明白自己是公共健康的一份子，不了解当地细菌的情况，就不能回答公共健康问题。正如前面谈到的意大利临床医生不调查肺炎链球菌血清型，就不知道7价结合疫苗是否还适用。这样的研究最好由临床医生来完成，这对政府决策将会是非常重要的信息。

姚开虎副研究员 谢谢Azzari教授精彩的学术报告和非常坦诚的交流。