应用SSR分子标记方法检测玉米种子真实性的几点思考

李巧英

（山西省农业种子总站，山西 太原 030006）

玉米是我国的第一大粮食作物，每年全国种植面积达3 333.3万hm2，需种量约11亿kg，庞大的市场份额吸引了众多的国内外种子企业进军玉米种子市场。市场上销售的玉米种子的品种越来越多，假冒侵权案件频发，市场监管难度进一步加大，用原来的蛋白检测方法已不能将现有的品种完全区分开来，而田间鉴定又受自然条件和品种表现性状的限制，鉴定周期较长。近年来，随着分子标记方法研究的发展，SSR分子标记方法检测玉米种子真实性已经得到广泛应用。但是在实际应用过程中，也存在许多问题，值得大家思考。下面就SSR分子标记方法检测玉米种子真实性试验中遇到的问题进行一些探讨。

1 检测样品的纯度问题

检测样品的纯度直接影响真实性检测结果的判定。如果检测样品采取混样提取DNA，由于检测样品纯度较低，检测后会出现单双带和双带、三带的现象，导致检测样品与标准样品的谱带不同，鉴定困难。遇到这种情况，我们需要进行样品提纯，一是将样品进行单粒提取DNA，与标准样品比较（如图1）后，剔除杂粒，再与标准样品比较，获得该样品的谱带类型，这种方法工作量较大；二是先做样品的蛋白质电泳，确定样品的纯度值，达到一定要求后再进行真实性检测，这样可以大大减少工作量，方法比较简单。

（如上图：检测样品出现3种带型，双带：1；双带：3、5；单带：2、4。标准样品为双带，带型一致，与 3、5 号检测样品的带型一致，表明检测样品不纯，将1、2、4号样品剔除后继续做其他引物。）

（上图中，检测样品1—5带型一致，均为单带。标准样品6—10出现两种带型，6、8为单带，与检测样品带型一致，7、9、10为双带，比检测样品多1条较小的带，无法确定标准样品的带型。）

2 标准样品的纯度问题

标准样品的谱带是鉴定样品的依据。如果标准样品的谱带不一致，无法确定该样品的真正谱带类型，很容易造成错误判断，导致结论偏差（如图2）。因此，玉米种子真实性检测中所使用的标准样品必须满足一定的要求，符合有关规定，且纯度合格。

3 DNA提取方法的问题

现在各个实验室采用的DNA提取方法很多，有CTAB法、SDS法等常规的方法，有改良后的方法，还有简化的方法。不管是用哪种方法，只要提取出来的DNA质量能够满足做SSR分子标记检测就可以，而且试验操作简单，方法容易掌握，使用药品试剂少，对环境的污染也减少。一些方法经过进一步试验验证后值得提倡。

4 混样检测和单粒检测的问题

玉米种子真实性检测可以混样提取DNA，也可以进行单粒检测。单粒检测工作量大，混样检测可以大大降低工作量。但是，如果样品的纯度比较低，混样检测后会出现与标准样品不同的谱带，还需要再进行单粒检测，以除去样品中的杂粒。实际操作中，可以将混样检测和单粒检测配合使用，对纯度较高的样品采取混样检测，纯度不高的样品宜采用单粒检测，去掉混入样品中的杂粒后再混样检测，以减少工作量。

5 引物检测的问题

SSR分子标记方法检测玉米种子真实性，目前主要采用检测40对引物，差异位点数≥2，判定检测样品与标准样品不一致。但是，在实际操作中，如果一个检测样品经检测出现两对引物谱带类型与标准样品不一致，是否还需要继续检测其他的引物；若检测，再检测多少对引物比较合适，这一问题还需要进一步试验验证。

6 电泳方法的选择

PCR产物检测方法可以选择小板胶电泳、大板序列胶电泳和毛细管电泳。3种方法比较，毛细管电泳检测精确度高、操作简单、省时省力，但是仪器本身、仪器维护、荧光引物、使用耗材等费用较高；序列胶电泳检测需要灌胶、电泳、染色、图片保存等程序，费时、费力，虽然费用较低，能够满足检测样品与标准样品之间的两两一致性比较，但是精确度较低，无法读出精确的数据结果；小板胶电泳检测灌胶、电泳、染色等程序相对简单，但是精确度更低，有些距离较近的谱带不能很好地分开。实际应用中，需要根据实验室条件具体考虑。

7 各个实验室间试验结果的对接

如果用毛细管电泳进行检测，可以得出较精确的数据结果，但是不同型号的仪器，甚至是相同型号的仪器，在不同的实验室都会出现一定的偏差，需要进行数据的矫正与整合，各个实验室间得出的检测结果才具有可比性。如果用大板序列胶检测，因为在序列胶上无法准确地读出检测样品的数据，只能看到它的相对位置，估测它的大小，要获得准确的数据结果，需要检测样品与一个参照值进行比较得出它的精确数据，才能实现实验室间数据的对接。