出口浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌的分离及相关生物学特性的研究

张宇霞，李 儒

(甘肃出入境检验检疫局综合技术中心，甘肃兰州730020)

脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)，俗称耐热菌、嗜酸耐热菌、耐热耐酸菌等，Cemy等首次从腐败的浓缩果汁中分离出一株含ω脂环酸的芽孢杆菌，并且证明该菌是造成巴氏灭菌果汁腐败的主要原因之一［1］。Wisotzkey 等人［2］根据其碱基对的含量、耐酸与耐热的特性、16S rDNA序列特性以及细胞膜特有的ω环状脂环酸，于1992年首次将其从芽孢杆菌属里分离出来，形成一个新属，称为脂环酸芽孢杆菌属。目前，该菌属包括17个已知种:A.acidocaldarius，A.acidoterrestris，A.acidiphilus，A.hesperidum，A.sendaiensis，A.vulcanalis，A.tolerans，A.disulfidooxidans，A.cycloheptanicus，A.herbarius，A.pomorum，A.contaminans，A.fastidiosus，A.kakegawensis，A.macrosporangiidus，A.Sacchari，A.shizuokensis;另外还有2个亚种:A.acidocaldarius subsp.Aidocaldarius和A.acidocaldarius subsp.Rittmannii［3］。大多数产芽孢细菌不能在果汁以及其它pH＜4.0的酸性环境中生长繁殖［4］，对酸性食品的杀菌多采用85～95℃巴氏杀菌就能收到了良好的效果。然而，高温瞬时杀菌不能消除的苹果浓缩汁产品中，抗逆性极强的脂环酸芽孢杆菌，这将严重影响着苹果浓缩汁产品的品质。中国是苹果第一大生产国，浓缩苹果汁也大量出口，为了提升浓缩苹果汁的品质，就要对其加工过程中脂环酸芽孢杆菌的污染和生长繁殖进行有效地控制，这就必须弄清楚这些脂环酸芽孢杆菌的类型、来源和生理生长特性等，以便采取针对性的措施。截至目前为止，我国对脂环酸芽孢杆菌属的研究尚处于初步阶段。因此，在我国开展该属新菌种的开发、鉴定，地域分布特性及源于果汁的新菌株的分离鉴定及其特性研究，对有效控制其危害具有十分重要的现实意义。本研究将对浓缩苹果汁生产线上的洗果水、冷凝水、苹果清汁、苹果浓缩汁等样品中的脂环酸芽孢杆菌进行分离、纯化，并对其生物学特性进行研究，以及考察脂环酸芽孢杆菌在生产线上的分布，以便为后续研究提供实验材料，为生产中脂环酸芽孢杆菌的控制提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Alicyclobacillus acidoterrestris(ATCC 49025)、Alicyclobacillus cycloheptanicus(ATCC 49029)、A.acidocaldarius(ATCC 27009) 美国标准生物品收藏中心(ATCC);苹果浓缩清汁(pH3.5～4.5、可溶性固形物含量为(71±1)°Brix) 甘肃省内各果汁生产企业;洗果水、浮洗水、沉淀池水 甘肃省内各果汁生产企业。

B6200型电热恒温培养箱 德国memmert公司;超净工作台 苏净集团安泰公司;台式电子天平德国赛多利斯公司;紫外分光光度计 美国PE公司;高压蒸气灭菌器 MLS3570，日本三洋公司;负压泵 美国GAST公司;杯式过滤除菌装置 上海信步科技有限公司;酸度计 德国赛多利斯公司;恒温振荡培养箱 SHA-C，常州中捷实验仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂环酸芽孢杆菌的分离培养

1.2.1.1 分离培养基的制备 按ATCC提供的1656 BAM-SM培养基配方并添加金属离子溶液配制成分离培养基。CaCl2·2H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.5g、(NH4)2SO40.2g、KH2PO43.0g、Yeast extract 6g、微量金属溶液 1mL(CaCl2·2H2O 0.66g，ZnSO4·7H2O 0.18g，CuSO4·5H2O 0.16g，MnSO4·4H2O 0.15g，CoCl2·6H2O 0.18g，H3BO30.10g，Na2MoO4·2H20 0.30g，分别溶于1L灭菌蒸馏水)，加入1000mL灭菌蒸馏水，充分搅拌溶解后用H2SO4调节pH至4.0，121℃高压灭菌15min，即为1656 BAM-SM液体培养基。若制1656 BAM-SM琼脂平板，先制备双倍液体培养基(即同溶液体积中各成分加倍，调p H4.0)和等体积的4%蒸馏水琼脂，然后为了防止琼脂被酸化将两者分别121℃高压灭菌15min，在无菌条件下将保温至50℃的双倍液体培养基和4%蒸馏水琼脂等体积混合，调pH至4.0后倾注平板，4℃保存备用。

1.2.1.2 样品来源及采集 样品采自浓缩苹果汁生产企业的浓缩苹果汁成品、浓缩苹果汁生产中最可能被脂环酸芽孢杆菌污染的主要生产工段，主要包括车间生产用水和设备清洗用水，比如洗果水、浮洗机水、沉淀池水等，无菌取样后立即送回实验室进行实验。

1.2.1.3 脂环酸芽孢杆菌的分离 浓缩苹果汁脂环酸芽孢杆菌的分离参照文献［5］的方法，用无菌吸管吸取10mL苹果汁于90mL无菌蒸馏水的三角烧瓶中稀释混匀，然后置于(80±1)℃的恒温水浴箱内处理13min，然后迅速置于冰水浴中冷却至室温。冷却后在无菌条件下使处理液通过装有孔径为0.45μm滤膜的过滤器进行抽滤，抽滤完毕后用无菌镊子将滤膜取下，贴于分离培养基平板上，45℃培养3～5d，待滤膜上长出明显菌落后直接从滤膜上挑取菌落，转入斜面培养，经过进一步分离纯化后得到纯培养的菌株。洗果水、浮洗机水、沉淀池水等生产用水脂环酸芽孢杆菌的分离，用无菌吸管吸取30mL(杂质较多时采用1000r/min低速离心吸取上清)于70mL无菌水的三角烧瓶中稀释混匀，其余步骤同浓缩苹果汁脂环酸芽孢杆菌的分离。将分离纯化后的菌株-20℃保存备用。

1.2.2 脂环酸芽孢杆菌的生物学特性观察

1.2.2.1 脂环酸芽孢杆菌的筛选 耐酸特性鉴定实验:将浓缩苹果汁和生产用水分离得到的纯培养菌株划线接种于LB平板培养基(pH7.0)，45℃恒温培养箱培养48h，保留不能在LB平板上生长的菌落［6］。

耐热特性鉴定实验:将浓缩苹果汁和生产用水分离得到的纯培养菌株接种于10mL无菌水制成菌悬液，于80℃温度下热休克处理13min，再采用涂布法接种于1656 BAM-SM琼脂平板培养24h，保留可以生长的菌落［5，7-8］。

1.2.2.2 脂环酸芽孢杆菌的细胞形态及菌落特征观察 对经过耐酸和耐热特性检验的菌株进行细菌和菌落形态的初步观察。

a.革兰氏染色:选取培养24h内斜面新鲜菌进行革兰氏染色处理，处理后进行显微镜观察其细菌形态［9］。

b.芽孢染色:选取培养24～48h斜面新鲜菌进行芽孢染色处理，处理后进行显微镜观察其芽孢形态［9］。

c.菌落特征:将标准菌株Alicyclobacillus acidoterrestris(ATCC 49025)、Alicyclobacillus cycloheptanicus(ATCC 49029)和经过耐酸和耐热特性以及革兰氏染色和芽孢染色检验的分离菌株分别接种于1656 BAM-SM琼脂平板培养24～72h，观察各菌落在培养基上的颜色、形状、大小等菌落形态。

1.2.2.3 生长条件实验 p H的确定:采用1mol/L H2SO4和1mol/L NaOH调节1656 BAM-SM固体培养基的 p H 分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，将标准菌株和分离菌株分别接种于不同p H的培养基上，培养2～5d观察其生长情况，初步确定菌株生长的pH，再将其精确到0.1，每个酸度重复实验2次。将菌株接种于微调后的不同pH培养基中，培养2～5d观察其生长情况，最终确定各菌适宜生长的p H。

生长温度的确定:将标准菌株和分离菌株分别接种于1656 BAM-SM固体培养基上，分别于20、30、40、50、60和70℃培养2～5d，根据初测结果温度调整各菌的生长温度范围，精确到1℃，将各菌株接种于培养基上置于微调后的不同温度下，培养2～5d，观察各菌生长情况，确定各菌适宜的生长温度。

1.2.2.4 生理生化反应特征 过氧化氢酶实验、氧化酶实验、明胶液化、V-P实验、淀粉水解、N源利用实验、吲哚实验、脲酶实验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐利用实验等均参照文献［9］的方法进行，为了保证脂环酸芽孢杆菌生长所需要的酸性条件，一般采用苹果酸酸化的培养基进行以上生理生化实验，同时利用生物梅里埃的API 50 CH生化反应试剂条进行标准菌株的生理生化实验。

1.2.2.5 标准菌株及分离菌株生长曲线的确定 分别将标准菌株和分离菌株的45℃、72h单个培养菌落接入100mL 1656 BAM-SM液体培养基中，于45℃温度下培养，分别在4、8、17、24、32、48、55、72、96h 取液体培养物10mL，测定菌体的吸光值，并同时将该液体培养物1mL经适当稀释后涂布于1656 BAM-SM固体培养基上，45℃、72h条件下进行培养，然后计数，分别建立标准菌株和分离菌株在45℃温度下的吸光值与培养时间以及吸光值与菌浓度之间的关系曲线。

表1 各菌株菌落形态观察结果Table 1 Observation results of colony morphology of different

表2 各菌株细菌形态观察结果Table 2 Observation results of cellular morphology of different strains

2 结果与分析

2.1 脂环酸芽孢杆菌的分离纯化及耐酸耐热性检验

通过对甘肃省内浓缩苹果汁生产企业的浓缩苹果汁成品以及浓缩苹果汁生产中最可能被脂环酸芽孢杆菌污染的主要生产工段，主要包括车间生产用水和设备清洗用水，比如洗果水、浮洗机水、沉淀池水等进行无菌取样，共采集144个样品，经过分离、筛选和纯化，共得到59株分离菌株。将分离菌株经过80℃温度下热休克处理13min，均能很好地生长，表明其有很好的耐热性;在1656 BAM-SM培养基上生长良好，但在LB培养基上均不能生长，证明其均有嗜酸性。因此可以初步证明本实验分离到的59株菌为嗜酸耐热且产生芽孢杆菌。

2.2 脂环酸芽孢杆菌的生物学特性

2.2.1 脂环酸芽孢杆菌细胞形态及菌落形态观察按1.2.1方法分离培养可以得到大量的耐热耐酸菌，这些耐热耐酸菌用通常的细菌检测方法难以检出，在45℃条件下常需要2～5d才可以形成明显的菌落。从各个样品分离出来的菌株的菌落形态学特征来看，样品中的耐热耐酸的脂环酸芽孢杆菌并不是单一形态的菌，而是表现为多形态的产芽孢杆菌。从中挑选出三株有代表性且与标准菌株十分相似的菌株，与标准菌株的菌落形态观察结果见表1，菌落形态见图1。由表1可知，分离菌株Ⅰ和分离菌株Ⅱ与标准菌株Ⅱ菌落特征十分相似，乳黄色、圆形、边缘整齐、表面有褶皱;而分离菌株Ⅲ与标准菌株Ⅰ菌落特征十分相似，乳白色、圆形、边缘不整齐、表面有少许褶皱，但三株分离菌株的菌落大小均小于标准菌株，只有1～3mm大小。分离菌株与标准菌株的细菌形态观察如表2和图2所示，由表2和图2可知标准菌株和分离株的细菌形态十分相似，均为杆状;革兰氏染色均为阳性;各菌运动性的镜检法观察结果表明，各菌均不运动;芽孢位置均为次端生或端生。

图1 分离株与标准菌株的菌落Fig.1 The colony morphology of standard and isolated bacteria

2.2.2 脂环酸芽孢杆菌生长条件的确定 按1.2.2.3的方法，标准菌株和分离菌株培养的生长实验结果见表3。由表3可知各菌温度条件在25～60℃范围内、pH在2.4～6.8范围内均能良好生长，从本实验得到的三株分离菌株与标准菌的生长条件基本相同。从它们的生长温度和p H范围可以看出，这些菌株不仅可以耐受酸性条件，并且还表现出对酸性条件的依赖性和嗜好性，均符合脂环酸芽孢杆菌特有的耐酸耐热的特性。

2.2.3 脂环酸芽孢杆菌生理生化反应结果分析 标准菌株和分离菌株的生理生化反应结果如表4所示。由表4结果可以看出，除分离菌Ⅲ的淀粉水解为阴性、分离菌Ⅱ和分离菌Ⅲ的N源利用为阴性，这两个特征与标准菌株不同外，其余各项生理生化特征与标准菌株相同。由此可见，3株分离菌株与标准菌株有明显相似的特征，而出现的差异恰恰可能是由于同属中不同菌种的差异造成的。

图2 各菌株显微镜形态观察结果(10×100)Fig.2 Micro-morphology of vegetative form(10×100)

表3 各菌株的生长条件分析结果Table 3 Results of cultural characteristics

表4 各菌株生理生化反应分析结果Table 4 Results of physiological characteristics

2.2.4 各菌株生长曲线结果 标准菌株Ⅱ与分离菌株Ⅱ在45℃温度培养下吸光值与培养时间以及吸光值与各菌细菌浓度之间的关系曲线图如图3所示。由图3可见，标准菌株与分离菌株的生长趋势比较一致，单个菌落在100m L 1656 BAM-SM液体培养基中在培养24h后开始进入对数生长期，32h进入稳定生长期，当生长到48h后菌体浊度缓慢降低，进入衰亡期。标准菌和分离菌在温度为45℃条件下培养48h后的A600为0.6～0.7时，活菌数量可以达到105～107CFU/m L。

3 讨论

图3 标准菌株和分离菌株的生长曲线Fig.3 The growth curve of standard and isolated

根据本实验室以及分离样品的实际情况选择了BAM培养基，并对该培养基进行适当调整，形成了1656 BAM-SM培养基，同时采用膜过滤法，该方法取样量大，而且能够截留富集果汁中的绝大多数脂环酸芽孢杆菌，对于分离该菌取得了良好的效果。本实验的苹果汁样品以及车间生产用水和设备清洗用水样品经过热处理，会杀灭样品中某些不能耐受高温的杂菌，减少了杂菌对培养结果的影响，同时在热处理过程中芽孢可能被激活，给予适当温度的处理会使芽孢萌发、繁殖。而分离样品中的车间生产用水和设备清洗用水由于pH高于浓缩苹果汁，使得杂菌数量和种类也相对增多，因此经过一定的热处理就更加必要，而且其中所含杂质较多，在热处理前经过低速离心以去除水样中的泥沙等杂质将增快膜过滤速度、减少杂菌污染有着重要的意义。

本研究从144个浓缩苹果汁和生产用水样品中，经过分离、筛选和纯化，首次得到59株分离菌株，将这59株菌株进行了耐热耐酸特性的实验，结果表明其均具有耐热耐酸的特性，符合脂环酸芽孢杆菌耐热耐酸的特点，初步表明和脂环酸芽孢杆菌同属于嗜酸耐热菌;又将其与标准菌株进行了细菌形态、菌落形态、生长条件以及生理生化反应特性的对比，发现其与标准菌株具有十分相似的特征，但同时也存在着一定的差别，故初步判断这59株分离菌株和标准菌株同属于一个属，但对具体种的划定尚需进行进一步的研究鉴定。

本研究对于生长曲线的实验中发现了单个菌落在100m L 1656 BAM-SM液体培养基中在培养24h后开始进入对数生长期，32h进入稳定生长期，当生长到48h后菌体浊度缓慢降低，进入衰亡期，这与文献中有差异［6-7，10］;以及标准菌和分离菌在温度为45℃条件下培养48h后的A600为0.6～0.7时，活菌数量可以达到 105～107CFU/m L，这与文献［11］在 47℃ 条件下培养24～48h A600为0.4～0.7时，活菌数量可以达到107～108CFU/m L也存在差异，这可能与选择的培养基、培养条件、该菌的不同地域分布特性是否会改变其生长特性等因素有关。对于生理生化特性的研究，有学者利用API CHB/E试剂盒进行糖醇利用实验的研究［6，12］，而 Pettipher GL［13］则认为 API CHB/E试纸条在37℃和44℃的结果不一致，不适用于鉴定脂环酸芽孢杆菌，在本研究中同时采用传统方法和APICHB/E试纸条进行了生理生化特性实验，结果表明APICHB/E试纸条适用于温度在37℃的嗜温菌，而温度提高到45℃以上时，其实验结果是否可信有待进一步验证，而且酸化的培养基对于使用API CHB/E试纸条，其结果也不明确;同时API CHB/E试纸条结果的判定是基于颜色的深浅判断，这对于结果阳性的判断也带来难度，带来不确定性，因此认为API CHB/E试纸条不适用于该菌生理生化特性的研究，是否可以用文献报道［12］将目标碳源(糖、醇)以2g/L直接加入BAM基础培养基中培养菌种，每隔7d测量pH来判断其碳源的利用情况的方法有待进一步研究。

4 结论

脂环酸芽孢杆菌是一种广泛分布于世界各地，存在于土壤、温泉、硫磺矿、有机物、肥料、热加工食品、地热含水层的水和沉渣等中的革兰氏阳性芽孢杆菌。研究结果表明，本实验中的144个浓缩苹果汁和生产用水样品，经1∶10稀释、生产用水3∶7稀释(杂质较多时采用1000r/min低速离心吸取上清)，(80±1)℃热处理13min，冰水浴中快速冷却至室温，0.45μm膜过滤后将滤膜取下贴于1656 BAM-SM固体培养基平板上，45℃培养3～5d得到了59株分离菌株。将其与标准菌株进行对比，发现其与标准菌株具有相似的培养特性和生理生化特性，可初步判断为脂环酸芽孢杆菌，但还需进行进一步的鉴定，这将为在我国开展该属新菌种的开发、鉴定，地域分布特性及源于果汁的新菌株的分离鉴定及其特性研究，对有效控制其危害提供实验材料，并且还将为后续研究提供实验依据，为生产环节中脂环酸芽孢杆菌的控制提供指导和依据。

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