丛枝菌根真菌对白三叶根系构型和糖含量的影响

吴强盛，袁芳英，2，费永俊，李莉，黄咏明，刘春艳

(1.长江大学园艺园林学院，湖北 荆州434025;2.京山县农业局，湖北 荆门431800)

根系构型指同一根系中不同类型的根(直根系)或不定根(须根系)在生长介质中的空间造型和分布［1］。根系构型的优劣直接影响植物对土壤养分和水分的吸收，进而影响植物的形态构建。根系构型最显著的特点是具有可塑性，受诸多因素的影响，如微生物等［2-4］。目前对根系构型的影响因素研究主要关注生长介质的营养状况以及植物基因型，关于土壤中的微生物对植物根系构型影响的研究甚少。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AM真菌)作为土壤中的一类有益微生物，能够与大多数植物根系建立丛枝菌根共生体，其在根外建立的菌丝网络已经显示了许多有益的功能，如促进寄主植物养分和水分的吸收，改善寄主植物生长，增强寄主植物的抗逆性，增强草坪植物［如狗牙根(Cynodon dactylon)］刈割后再生能力等［5-6］。已有研究结果表明，在葡萄(Vitis vinifera)上接种AM真菌聚生球囊霉(Glomus fasciculatum)显著提高其二级侧根和三级侧根的数量［7］。然而，接种珠状巨孢囊霉(Gigaspora margarita)和地表球囊霉(G.versiforme)对枳实生苗根系的总长度、投影面积、表面积、平均直径、体积等没有显著影响，摩西球囊霉(G.mosseae)和苏格兰球囊霉(G.caledonium)接种还显著降低了根系总长度、面积和体积［8］。因此，进一步通过不同AM真菌种类来验证其在根系构型上的效应显得十分必要。另一方面，根系的生长发育需要碳水化合物作为能量来源或者反应底物，即植物体内糖含量变化会影响根系构型的优劣［9］。而AM真菌也需要消耗4% ～20%的寄主植物光合碳水化合物以维持自身的生长发育［10］。在这个过程中，AM主要吸收根系的葡萄糖，而不是蔗糖［11］。而根系的碳水化合物主要依赖叶片的蔗糖经过韧皮部下运。在AM存在条件下植物叶片和根系蔗糖和葡萄糖含量有何变化，目前还不清楚。此外，在接种AM真菌条件下，植物蔗糖和葡萄糖的根系分配率与植物根系构型有正的相关关系［12］。因此，进一步明确根系构型－AM－碳水化合物三者间的关系，对明白菌根改变根系构型至关重要。

白三叶(Trifolium repens)作为我国广泛栽培的牧草之一，具有产量高以及再生速度快、匍匐生长等特点，也成为绿地定植的草种之一［13］。在白三叶根际存在许多的有益微生物，如植物根际促生菌、AM真菌等［14］。本研究以白三叶为寄主植物，通过接种不同AM真菌对植株生长、根系构型、叶绿素和组织糖含量的变化，探讨AM真菌对植物根系构型的效应及这种效应发生的可能机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为白三叶。供试AM真菌为粘屑多样孢囊霉(Diversispora spurca)、地表球囊霉(Glomus versiforme)和隐类球囊霉(Paraglomus occultum)，由北京市农林科学院植物营养与资源研究所“丛枝菌根真菌种质资源库”(BGC)提供，菌根接种体的形式是感染的高粱(Sorghum vulgare)根段、菌丝、孢子和沸沙的混合物。试验用盆为塑料盆，规格是:上口径16 cm、下内径11 cm、盆高13 cm。盆里预先装有高压蒸气灭菌(121℃，0.11 MPa，2 h)的黄棕壤与蛭石按照1∶1(体积比)混合基质，2010年10月19日进行播种，播种前预先对种子采用70%酒精表面消毒5 min，蒸馏水冲洗3次后，点播于塑料盆基质表层0.5 cm处，每盆点播35粒种子，5 d后保留至30株/盆。所有的试验盆置于PQX人工气候箱培养，25℃白天/18℃晚上，16 h光照/8 h黑暗。

1.2 试验设计

试验共设4个处理，包括接种粘屑多样孢囊霉、地表球囊霉、隐类球囊霉和不接种丛枝菌根真菌(non-AMF)的对照。接种AM真菌处理的每盆15 g菌剂。每个处理重复3次，每盆30株白三叶，共12盆，随机排列。

1.3 测定方法

在培养箱中经过85 d生长后结束实验，收获各个处理的叶片、根系，仔细地将根系从栽培基质中取出，尽可能不伤害根系，用自来水洗净后，采用EPSON平板扫描仪采集完整的根系图片，然后对图片用WinRHIZO根系分析软件分析根系构型参数，包括长度、投影面积、表面积、体积、平均直径、根尖数、分支数和交叉数。每盆30株三叶草根系均用于根系扫描，30株的根系构型参数平均值作为1次重复。

从每个处理中随机选取15株，于70℃下烘干48 h，然后测定地上部和地下部干重。剩余每盆15株的叶片混合，采用80%丙酮提取，于646和663 nm下比色测定叶绿素含量［15］;部分根系剪成1 cm左右的根段，菌根的染色依次经过10%KOH 在90℃透明30 min，10%H2O2漂白10 min，0.2 mol/L HCl酸化10 min，0.05%曲利苯蓝染色10 min［5］，菌根侵染率用菌根侵染的根段长度占检查根段的总长度的百分数表示。

蔗糖和葡萄糖含量采用比色法［16］进行。取50 mg过筛(1 mm)干样，加入4 mL 80%酒精在80℃水浴40 min，2500 r/min收集上清液，残渣加4 mL 80%酒精重复提取1次，合并上清液，其中叶片提取液加入10 mg活性炭于80℃水浴脱色30 min，过滤。等量的酒精提取液与2 mol/L NaOH混合，沸水浴5 min，冷却，加入30%HCl和0.1%间苯二酚，摇匀，80℃水浴10 min，冷却后480 nm处比色测定蔗糖含量。取1 mL酶制剂(邻联茴香盐酸盐、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶混合物，pH 5.5)，加入0.5 mL酒精提取液，30℃保温5 min，然后加入2 mL 10 mol/L H2SO4，于460 nm处比色测定葡萄糖含量。

1.4 统计分析

运用SAS 8.1软件的ANOVA过程对处理间作差异性测验，LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同AM真菌对白三叶菌根侵染率的影响

从表1可知，3个不同属的AM真菌都能侵染白三叶根系，菌根侵染率范围为66.80% ～82.51%，其中G.versiforme对白三叶根系的侵染率最高，且显著高于其他2个菌种，而D.spurca和P.occultum接种处理间没有显著差异。

2.2 不同AM真菌对白三叶生物量的影响

表1还表明，3种AM真菌接种都能显著地提高白三叶地上部干重、地下部干重、植株总干重，各个菌种处理间也表现显著差异，其中G.versiforme处理的效果最好，且显著高于D.spurca和P.occultum的处理，而D.spurca和P.occultum处理间没有表现显著差异。此外，D.spurca、G.versiforme、P.occultum接种处理显著地抑制了根冠比，分别抑制17%，16%和17%，各个菌种处理间没有表现显著差异。

表1 3种AM真菌对白三叶菌根侵染率和生物量的影响(n=3)Table 1 Effects of three AM fungi on mycorrhizal colonization and biomass production of white clover(n=3)

2.3 不同AM真菌对白三叶根系构型的影响

图1显示，接种AM真菌的白三叶根系构型明显地优于未接种AM真菌的对照。表2也显示，D.spurca、G.versiforme、P.occultum接种显著提高白三叶植株根系构型参数如长度、投影面积、表面积、体积、根尖数(除D.spurca外)、分支数和交叉数。在3个AM真菌处理中，以G.versiforme处理的效果最明显，对根长度、投影面积、表面积、体积、根尖数、分支数和交叉数分别提高44%，42%，38%，42%，86%，57%和56%。但是，所有的AM真菌处理都没有显著地改变根系平均直径。

表2 3种AM真菌对白三叶根系构型的影响(n=3)Table 2 Effect of three AM fungi on root system architecture of white clover(n=3)

图1 接种不同AM真菌的白三叶根系构型Fig.1 Root system architecture of white clover plants inoculated with or without AM fungi

2.4 不同AM真菌对白三叶叶绿素以及蔗糖和葡萄糖含量的影响

表3显示，接种D.spurca、G.versiforme和P.occultum都显著地提高了白三叶叶绿素含量，分别提高36%，58%和38%，但3个AM真菌处理间没有显著差异。

另一方面，接种D.spurca、G.versiforme和P.occultum均显著地提高了白三叶叶片和根系葡萄糖含量，在叶片中分别提高51%，43%和26%，在根系中提高35%，66%和33%(表3);D.spurca接种的叶片葡萄糖含量显著高于P.occultum，G.versiforme接种处理的根系葡萄糖含量最高，显著高于其他2个菌种处理，而D.spurca和P.occultum处理间无差异。接种D.spurca、G.versiforme和P.occultum也显著地提高了白三叶叶片蔗糖含量，分别提高54%，32%和16%，3个菌种处理间均存在显著差异。在根系中，接种D.spurca和P.occultum显著提高了其蔗糖含量，分别提高了23%和38%，2个菌种处理间无显著差异;而G.versiforme则显著降低其蔗糖含量，降低了45%。

表3 3种AM真菌对白三叶叶绿素以及蔗糖和葡萄糖含量的影响(n=3)Table 3 Effects of three AM fungi on chlorophyll，glucose and sucrose contents of white clover(n=3)

3 讨论

许多研究已经证实，接种AM真菌能够促进植物生长，如株高、茎粗、叶片数、生物量等［16-17］。本研究也证实，接种D.spurca、G.versiforme和P.occultum能够显著提高白三叶的地上部、地下部及植株总干重，其中以G.versiforme的效果最显著。毕银丽等［18］研究结果也表明，生长基质施磷肥与否对AM真菌促进白三叶生物量效果没有影响。这种提高一方面与根外菌丝参与水分和养分有关［19］，另一方面也与接种AM真菌后改善白三叶根系构型相关，因为根系构型的改善能够帮助植物从土壤中吸收更多的矿质营养和水分，而增加生物量的效果因AM真菌的种类不同而表现出差异。此外，接种AM真菌降低了白三叶的根冠比，这暗示着丛枝菌根真菌对植株地上部分的促进作用大于地下部分。

本研究表明，接种AM真菌的白三叶根系构型参数如长度、投影面积、表面积、体积、根尖数、分支数和交叉数显著高于不接种AM真菌的对照，其中以G.versiforme处理的效果最明显，说明AM真菌作为一种有益微生物能够影响白三叶的根系构型，且显示了促进的效应。这与Wu等［20］在红橘(Citrus tangerine)上接种G.mosseae的研究结果一致。Yao等［8］在枳(Poncirus trifoliata)上接种 G.caledonium、G.intraradices、G.versiforme和 Gigaspora margarita的研究结果表明，AM真菌没有显著改变这些根系构型参数。这暗示了丛枝菌根改善根系构型依赖寄主植物和AM真菌两者的兼容性。AM真菌改善根系构型可能与AM真菌诱导根系腐胺合成酶活性正相关，从而调节内源多胺代谢，进而影响根系构型［20］。

AM真菌属于异养型真菌，需从寄主体内获取碳源，根内菌丝主要从根系中吸收己糖，优先于葡萄糖，从而在根系建立“菌根碳库”［10-11］。本研究表明，接种AM真菌显著提高了白三叶叶片和根系的葡萄糖含量，其中接种G.versiforme的效果最显著。菌根化植株组织内更高的葡萄糖含量为AM的发育提供了碳源。接种AM真菌的白三叶叶片蔗糖含量显著高于未接种的对照，根系中的蔗糖含量除接种G.versiforme外，都高于未接种的植株。这充分说明AM存在能够有利于根系碳库的积累，特别是葡萄糖。AM真菌通过提高寄主植物(如本研究的三叶草)叶绿素含量，因而改善植物的光合参数，提高植株叶片光合速率，间接获得比对照更多的碳水化合物，进而改善植物的碳素营养［21］。相关性分析显示，白三叶叶片的葡萄糖(r=0.852，P＜0.01)和蔗糖含量(r=0.722，P＜0.01)以及根系葡萄糖含量(r=0.884，P＜0.01)均与菌根侵染率呈极显著的正相关关系。进一步暗示更高的葡萄糖将有利于AM的形成和发育。在本研究中接种G.versiforme的白三叶根系蔗糖含量低于没接种的对照，可能是白三叶对G.versiforme的依赖性强(植株生物量和菌根侵染率均最高)，根系中的蔗糖更多地降解成葡萄糖供AM发育，因而建立最高的菌根侵染率，导致根系蔗糖含量的下降。蔗糖的裂解依赖蔗糖酸性转化酶、中心转化酶、碱性转化酶以及蔗糖合成酶(分解方向)，AM真菌对白三叶蔗糖裂解酶有何影响，还需进一步深入研究。

此外，根系的生长和发育也依赖植物形成的光合碳水化合物，主要以蔗糖为底物［9，22］。这些碳水化合物可直接作为代谢底物或生长调节物质影响细胞的分裂，导致根系构型发生变化［23］。在菌根化植物中由于“菌根碳库”的存在，地上部分的蔗糖经长距离运输向根系的分配比率提高［10］。所以，在菌根化白三叶中接种AM真菌(除G.versiforme外)显著提高其根系蔗糖的含量。菌根诱导的蔗糖一方面被分解成葡萄糖，供AM的生长发育，另一方面为根系的发育提供了代谢底物，有利于根系构型的建立。因此，可以推断，在植物根系中接种AM真菌，能提高寄主植物叶片的蔗糖向地下根系的分配，从而有助于AM的发育，进一步发挥AM的水分和养分吸收功能，也有利于根系构型的建立。

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