马铃薯和拟南芥GAPC酶基因的克隆及分析

邹雪，张烨，吴明阳，王西瑶

(四川农业大学农学院，四川成都611130)

3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是生物中普遍存在的酶。在高等植物中，根据其存在位置、催化的反应可分为3类:1)磷酸化NAD依赖型和非磷酸化NADP依赖型，由4个相同GapC亚基组成，存在于胞质中参与糖酵解，前者催化的反应产生含高能磷酸键的产物并在下一步反应中生成3-磷酸甘油酸和ATP，后者催化反应直接形成3-磷酸甘油酸，没有ATP的产生;2)磷酸化NAD依赖型，存在于质体中;3)磷酸化NADPH依赖型，由GapA和GapB两种亚基组成，存在于叶绿体中，参与卡尔文循环［1-2］。由于糖酵解和卡尔文循环都是植物细胞能量代谢的主要途径，因此GAPDH在植物碳代谢和能量代谢中起关键作用。Brinkmann等［3］、Russell和 Sachs［4］最初从玉米(Zea mays)中克隆到 3个胞质三磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPC)［3-4］，迄今已从多种植物中克隆到该基因，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum)［5-7］。最初人们认为GAPC蛋白仅参与糖酵解其mRNA在细胞内表达稳定，因此将GAPC作为RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录-聚合酶链式反应)等检测中的内参基因，但近年来越来越多的研究表明植物GAPC对盐、干旱、高渗、低温、高温、活性氧、低磷、病菌侵染等多种逆境胁迫均有响应，并通过过量表达GAPC基因获得了抗盐胁迫的水稻和马铃薯(Solanum tuberosum)［8-14］。

磷对重要粮食作物马铃薯的块茎形成以及淀粉积累都有良好的促进作用，并交叉影响抗逆表现，而我国农田有2/3缺磷，因此研究马铃薯的磷吸收利用机制并通过生物技术增强马铃薯对磷的吸收和利用效率具有重要意义［15-18］。王西瑶等［10，19］从拟南芥耐低磷突变体中首先鉴定到At GAPC2蛋白与耐低磷性状相关，进一步分析表明低磷诱导该基因(AtGAPC2)转录增强，T-DNA插入突变体表现出对低磷胁迫的敏感性。Penaloza等［9］研究发现白羽扇豆(Lupinus albus)在低磷胁迫的早期及晚期与NAD-依赖型GAPDH同源的基因表达增强，推测糖酵解在白羽扇豆响应低磷胁迫的特殊机制中起作用。但 Hajirezaei等［20］通过反义技术沉默马铃薯 GAPC基因(StGAPC)，表明该基因在马铃薯块茎形成的代谢调节上仅发挥次要作用。

StGAPC和AtGAPC2所编码的蛋白在功能多样性上是否具有差异，GAPC的过量表达能否提高马铃薯对低磷、盐等多种逆境胁迫的抗性，为此本实验分别克隆了这2个基因并对两者的序列和蛋白结构作对比分析;同时利用多种植物的GAPC序列建立进化树，分析环境胁迫对GAPC进化及功能多样性产生的影响;最后分别构建了这2个基因的植物表达载体，为进一步验证GAPC的功能多样性并获得耐逆境胁迫的马铃薯材料奠定基础。

1 材料与方法

1．1 试验材料

野生型拟南芥种子(Columbia生态型)，由四川农业大学玉米研究所张素芝教授提供。马铃薯栽培型品种米拉，由四川农业大学农学院马铃薯研究开发中心提供。植物表达载体pBI121由四川农业大学李立芹副教授惠赠，克隆载体pMDTM19-T Simple Vector(TaKaRa)购自宝生物公司。

1．2 方法

1．2．1 AtGAPC2和StGAPC基因的克隆 实验于2010年10－12月在四川农业大学农学院马铃薯研究开发中心完成，分别取拟南芥和马铃薯幼苗叶片100 mg，采用Trizol法提取总RNA，以40μL DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理水溶解。反转录合成cDNA第一链，体系为20μL，在用DEPC处理过的无菌0．2 mL PCR管中依次加入:oligo dT 1μL，RNA 3μL，DEPC处理水8μL，轻微混匀并离心30 s，65℃变性5 min，冰上急冷2min，按序加入5×Reaction Buffer 4 μL，RNase抑制剂 (20 U/μL)1 μL，10 mmol/L dNTPMix 2 μL，反转录酶 (200 U/μL)1μL。轻微混匀稍离心，42℃，60 min，72℃ 10 min终止反应。以第一链为模板，PCR扩增目的片段，根据NCBI上公布的AtGAPC2(拟南芥)和StGAPC(马铃薯)的CDS全长序列(Accession No．AY090275，AF527779)，用Oligo 6软件分别设计引物并引入XbaⅠ、SmaⅠ酶切位点。

AtGAPC2 P1:5'TCTAGAATGGCTGACAAGAAGATCAGAAT3'，P2:5'CCCGGGTTAGGCCTTTGACATGTGAACG3'。

StGAPC P1:5'TCTAGAATGGCCAATGGCAAGATCAAAAT3'，P2:5'CCCGGGTCAAGCCTTGGCCATAT3'。

PCR 扩增体系为25 μL，反应体系中加入:ddH2O 16 μL，10×PCR buffer 2．5 μL，P1(10 μmol/L)0．5 μL，P2(10 μmol/L)0．5 μL，dNTPMixture(2．5 mmol/L)2．0 μL，cDNA，1．0 μL(拟南芥或马铃薯)，TaKaRa Ex Taq 0．5 μL，MgCl22．0 μL。PCR 扩增反应条件，拟南芥:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延长60 s，30个循环;72℃ 延长10 min。马铃薯:95℃预变性3 min;95℃变性30 s，68℃退火延长90 s，30个循环;68℃ 延长10 min。产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1．2．2 基因克隆及测序 电泳检测后回收纯化目的片段，与克隆载体pMDTM19-T Simple Vector在4℃连接24 h，10 μL 连接体系如下:pMD19-T Vector 0．5 μL，Insert DNA 3．5 μL，Solution I 5 μL，ddH2O 1 μL。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在涂有X-gal(20 mg/mL)40μL和IPTG(200 mg/mL)4μL的含Amp(100μg/mL)的LB平板上作蓝白斑筛选。将筛选的白色单克隆提质粒作PCR检测和质粒酶切鉴定，酶切反应体系20μL:XbaⅠ和 SmaⅠ0．5/0．5 μL，0．1%BSA 0．2 μL，10 ×T Buffer2．0 μL，ddH2O 1．8 μL，质粒15．0 μL。30℃水浴6 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测。最后各随机选取3个克隆，3次重复测序(上海生工生物工程股份有限公司)。

1．2．3 序列分析与比较 将测得的序列拼接后通过NCBI的BLAST寻找核苷酸同源序列(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/)。利用ProtParam程序预测氨基酸序列分子量和理论等电点(pI)、不稳定系数等，用ProScale程序预测蛋白疏水性，通过Conserved Domains程序进行保守功能区分析(http://au．expasy．org/)。将氨基酸序列提交Swiss-Model预测三级结构，用Rasmol 2．6查看图像。用Clustal X和DNAMAN对克隆的两种基因作核苷酸和氨基酸序列比对，并将NCBI中不同植物的GAPC序列数据作进化树分析。

1．2．4 植物表达载体的构建 用内切酶Xba I和Sma I对表达载体pBI121和克隆载体pMD-AtGAPC2、pMDStGAPC 进行酶切，酶切体系50 μL:10 ×T Buffer 5．0 μL，0．1%BSA 5．0 μL，Xba I和 Sma I 1．0 μL，质粒30．0 μL，ddH2O 8．0μL，30℃进行4～6 h。电泳后切胶回收相应片段连接，连接体系20．0μL:T4 DNA连接酶(3 U/μL)2．0 μL，10 ×Buffer 2．0 μL，pBI121 Vector 4．0 μL，目的片段 12．0 μL，4℃24 h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，在含卡那霉素(Kan，50μg/mL)的平板上筛选阳性克隆，经质粒PCR、酶切鉴定后将正确的重组质粒用冻融法转化到根癌农杆菌EHA105的感受态中，在含Kan+(50μg/mL)和利福平(25μg/mL)YEB平板上挑选单菌落扩增培养后提质粒作PCR鉴定。

2 结果与分析

2．1 AtGAPC2和StGAPC基因的克隆

从野生型拟南芥Col和栽培型马铃薯品种米拉中分别提取RNA，经凝胶电泳检测，如图1A所示，有28S，18S以及5S三个条带，说明RNA的完整性较好。由Oligod(T)作引物转录合成cDNA第一链，以此为模板，根据Genbank公布的序列设计引物，用高保真DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq扩增目的条带，取2μL扩增产物进行电泳检测，表明得到了预期大小的片段(约1000 bp，图1B)。回收目的片段，与克隆载体pMDTM19-T Simple Vector连接后转化大肠杆菌DH5α，挑选白斑进行滞后质粒筛选(图2A)，进行PCR及XbaⅠ、SmaⅠ双酶切检测(图2B、图2C)。检测结果表明无论是扩增还是酶切均能获得1000 bp左右片段。

图1 总RNA提取及RT－PCR扩增GAPC基因Fig．1 Total RNA extraction and GAPC gene am plification

图2 含目的基因的克隆检测Fig．2 Identification of clones

挑选重组子pMD-AtGAPC2和pMD-StGAPC各3个，每个3次重复作测序，其中pMD-AtGAPC2有2个重组子的序列与公布序列完全一致，另有1个发生A到G的变异。而pMD-StGAPC的3个重组子与公布序列均有差异:其中1个在404 bp处由T变为C;1个在143 bp处由T变为C，且871 bp处由G变为A;第3个在976 bp处由T变为A，由于3个重组子与公布序列的差异在不同位置，所以很可能是PCR扩增时碱基错配造成，另选3个pMD-StGAPC重组子测序，其中2个与公布序列完全一致，另1个在158 bp处C变为T，601处A变为G。将所获得的测序正确克隆扩繁后再作测序，仍与公布的序列完全相同，至此获得了与公布序列完全一致的AtGAPC2和StGAPC基因的克隆。

2．2 StGAPC和AtGAPC2序列分析

2．2．1 StGAPC和AtGAPC2氨基酸序列分析和结构域预测 测序结果表明，两者的开放阅读框均为1017 bp，编码338个氨基酸和1个终止密码子。两者的比对表明核苷酸序列相似性为84%，氨基酸序列相似性达到92%。St GAPC氨基酸序列分子量为36．646 kDa，理论p I值6．34，整个氨基酸组成中缬氨酸(Val)含量最高达10．4%，其次是丙氨酸(Ala)占9．8%，蛋白不稳定系数为20．21，属稳定蛋白;At GAPC2氨基酸序列分子量为36．913 kDa，理论p I值6．67，整个氨基酸组成中缬氨酸(Val)含量最高达11．5%，其次是赖氨酸(Lys)占9．2%，蛋白不稳定系数为22．6，属稳定蛋白。以上可以看出两者的基本性质相似。从图3A可以看出两者在氨基酸序列上共有26处存在差异，有些是同类氨基酸间的转变如:K-R、A-V、S-T、D-E，有些则是非极性与极性间的转变如:G-K、A-P、MT、A-E。

图3 St GAPC和At GAPC2氨基酸序列与单体三维结构比较Fig．3 A ligment of am ino acid sequence and monomer 3D structure of St GAPC and At GAPC2

利用NCBI网站的Conserved Domains程序作保守功能区分析表明St GAPC和At GAPC2具有GAPDH典型的2个保守区域:NADB_Rossmann(登录号cl09931)，即N端NAD(P)结合域;Gp_dh_C(登录号pfam02800)，即C端行使糖结合功能和催化功能的区域。两者均含所有GAPDH催化活性位点固有的特征序列ASCTTNCL(两多肽链上的154～161位)(图3A中下划线所示)。

2．2．2 St GAPC和At GAPC2蛋白结构预测 利用Swiss-Model在线分析功能预测St GAPC和At GAPC2蛋白的三级结构，两者均与模板3e5rC(Oryza sativa GAPDH C chain)的相似度最高，分别为85．629%和85．586%，并得到了St GAPC和At GAPC2蛋白单体的3D预测结构(如图3B所示)，三者的3D结构非常相似，其中左边区域有一个由7个β折叠构成的马鞍型超二级结构位于催化结构域中，起着固定活性中心的作用，而右边区域的βαβαβ结构形成Rossmann卷曲为结合NAD的区域。St GAPC蛋白单体包含16个α螺旋，22个β折叠，36个转角;At GAPC2蛋白单体包含16个螺旋，22个β折叠，37个转角;而3e5rC有15个α螺旋，20个β折叠，40个转角。图3B中1号和2号箭头分别表示这两种蛋白都有而3e5rC没有的2个β折叠和1个α螺旋，3号箭头显示出两者在参与形成该螺旋的氨基酸数目上有差异，而三者在N末端和C末端均有差异。

2．2．3 GAPC基因序列的同源性比较 将不同科、属植物GAPC的核苷酸序列(CDS)以及氨基酸序列用DNAMAN作同源比对。结果显示与马铃薯同科的植物中，普通蕃茄(Lycopersicon esculentum)核苷酸序列同源性与其最高为96．3%，其次是大叶烟草×花烟草(N．langsdorffii×N．sanderae)90．8%，野生型马铃薯(Solanum chacoense)和普通烟草(Nicotiana tabacum)与之同源性较低为80%左右;而氨基酸序列间的同源性高于核苷酸依次为98．6%，94．4%，89．3%，91．5%。AtGAPC2 与 AtGAPC1 以及同科的芥菜(Brassica juncea)、油菜(B．napus GAPC1和GAPC2)、白菜(B．rapa)等核苷酸序列同源性均为90%左右，而氨基酸同源性则高达98% ～96%。StGAPC和AtGAPC2都与禾本科植物，如玉米、水稻、小麦(Triticum aestivum)等的同源性较低，核苷酸为76% ～78%，氨基酸为85% ～87%。

根据多种植物GAPC基因的CDS序列建立如图4所示进化树，蕨类植物复活卷柏与其他被子植物处于两大分支中，被子植物中的单子叶植物水稻、玉米、小麦、毛竹与其他双子叶植物处于不同分支，而双子叶植物中拟南芥、油菜、白菜等十字花科在一个分支中，同属藜科的大洋洲滨藜和甜菜在同一分支，同属豆科的大豆和豌豆在同一分支，其他科、属的植物也按此聚类，基本与现有的分类系统相符。但同为茄科的马铃薯栽培型、番茄、大叶烟草×花烟草为一个分支，而马铃薯野生型、矮牵牛、普通烟草则出现在较远的另一分支。

图4 GAPC基因的进化树分析Fig．4 Phylogenetic tree analysis based on nucleotide of GAPC

2．3 StGAPC和AtGAPC2基因植物表达载体构建

将植物表达载体pBI121和克隆载体分别酶切，并回收相应片段，纯化连接，构建了CaMV35S驱动GAPC基因表达的载体。以重组子为模板PCR扩增GAPC基因，可扩增出约1000 bp左右的片段(图5A)，用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切重组质粒，也可获得1000 bp左右的片段(图5B)。检测结果说明GAPC基因片段已插入表达载体pBI121上，将获得的重组质粒分别命名为pBI121-StGAPC和pBI121-AtGAPC2。

采用冻融法将两种表达载体分别转入感受态农杆菌EHA105中，在含Kan的平板上获得单菌落，各选2个单菌落提质粒，PCR扩增Kan抗性基因nptⅡ和目的基因GAPC，如图5所示，能扩增出预期的650和1000 bp左右的片段，说明获得了分别含pBI121-StGAPC和pBI121-AtGAPC2质粒的两种菌株。

图5 表达载体PCR与酶切检测Fig．5 Identification of expression vector by enzyme digestion

图6 质粒转化农杆菌的PCR验证Fig．6 Identification of EHA105 transformed into p lasm id by PCR

3 讨论

胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶是由4个同型亚基组成的四聚体蛋白，Marri等［21］将拟南芥磷酸化GAPDH基因作了分类和表达研究，其中GapC为胞质内NAD依赖型的GAPDH，在糖酵解、糖质新生代谢中行使功能，由2个基因GapC-1和GapC-2编码，两者cDNA相似性为89%，氨基酸序列相似性达97．9%，本实验克隆了其中的At-GAPC2基因。目前认为造成克隆序列间差异的原因主要有品种差异、PCR扩增时的碱基错配、测序错误或者发生中性突变［22］。本实验根据测序，筛选到了与Gen-Bank公布的序列完全一致的克隆。而同时测序的几个克隆中，与公布序列在不同位置有1个或2个碱基的变异，这可能是PCR扩增过程中的碱基错配造成。所克隆的StGAPC和AtGAPC2核苷酸序列的相似性为84%，氨基酸序列相似性达92%，氨基酸转变会有疏水性变化，最终会使3D结构产生差异，这些差异是否会造成StGAPC和AtGAPC2功能间的差异还需进一步研究。

由于植物GAPC氨基酸序列间的同源性很高，遗传密码的兼并性可能会掩盖进化差别，降低进化树的可信度，因此本实验利用GAPC的核苷酸序列构建进化树，发现与现有的分类系统基本相符，这与肖川等［6］对多个物种GAPDH基因的分子进化研究结果相同，其研究表明叶绿体的GAPDH基因更接近原核生物，低等植物苔藓较早分支，裸子植物和被子植物处于两大分支，被子植物中单子叶植物和众多双子叶植物也处于不同分支，认为GAPDH作为分子进化研究材料有较高可信度。GAPC在同科、属间的同源性较高，说明在进化上较为保守，这与其参与糖酵解这一基本生理活动有关。对其他不同基因的研究所构建的进化树分析也表明各基因的属内同源性较高可归于同一分支［22-25］。研究表明西伯利亚蓼的GAPDH可提高酵母的抗盐碱胁迫能力，并且该基因与盐生植物冰叶日中花的遗传距离最近，推测逆境胁迫的作用使植物GAPDH基因的进化方向和功能趋于相同［7］。本实验所构建的进化树中，茄科植物出现了同属但不在一个分支，不同属反在同一分支的现象，如马铃薯栽培型(茄属)、番茄栽培型(番茄属)、大叶烟草×花烟草(烟草属)为一个分支，而马铃薯野生型(茄属)、矮牵牛(矮牵牛属)、普通烟草(烟草属)出现在另一分支。马铃薯栽培型在遗传上是四倍体而野生型是二倍体，可能对不同生长环境的适应及染色体倍性的变化影响着GAPC基因的进化。进化树的构建是一个统计学问题，所构建出来的进化树只是对真实进化关系的模拟，所以单凭GAPC序列建立的进化树还不能充分反映出马铃薯栽培型和野生型间的进化关系。

GAPC是糖酵解中的关键酶之一，催化3-磷酸甘油醛形成含高能磷酸键的1，3-二磷酸甘油酸和NADH，前者在下一步反应中生成3-磷酸甘油酸和ATP，过去认为GAPC在细胞内表达稳定但近年来的研究表明GAPC具有功能多样性。动物中的研究表明GAPC除参与糖酵解外，还参与细胞凋亡、调节mRNA稳定性、氧化胁迫应答、细胞自我吞噬、介导细胞信号转导、组蛋白基因调节等，并对GAPC在这些过程中的作用机理都有深入研究和解释［26］。植物中发现GAPC能够响应多种逆境胁迫，但研究的深度滞后于动物。关于GAPC响应高温、低温、活性氧、低磷、盐等多种逆境胁迫已被不同研究者所证实［8-12］，而通过转基因技术也表明GAPC基因的过量表达能提高植物对盐胁迫的抗性［13-14］，抑制表达则影响代谢和生长［27］。但目前关于GAPC在植物抗逆胁迫中如何起作用的研究还不够深入，Zhang等［14］对水稻的研究表明OsGAPC3过量表达的转基因材料中，与水稻抗逆相关的基因CatA、DREB2A、Lip9表达量高于对照，并且H2O2含量低，植株的耐盐胁迫能力提高。这从一定程度上解释了过量表达GAPC提高耐盐胁迫的原因。Gou等［28］利用双分子荧光互补充技术，发现H2O2能促进拟南芥GAPCs和磷脂酶D的相互作用从而增强磷脂酶D的活性，证明GAPC参与ABA诱导的逆境胁迫信号转导过程，这一研究揭示了GAPC的调节功能和作为逆境信号转导中的节点作用。本研究克隆了马铃薯和拟南芥GAPC，并构建植物表达载体，这将为进一步通过转基因和酵母双杂等途径研究两者在马铃薯抗逆中的功能机制奠定基础。

4 结论

本实验通过RT-PCR技术，克隆了马铃薯和拟南芥的胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的开放阅读框序列(CDS)，对其核苷酸和氨基酸序列以及蛋白结构作对比分析，并构建了植物表达载体，为下一步基因功能的研究以及获得耐逆境胁迫的材料奠定基础。

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