艾草白粉病的病原菌鉴定

张菊��+张怡��+曹鹏��+安一博��+黄辉��+袁俊慧��+王瑞瑞��李成伟

摘要：为了研究周口地区出现的艾草白粉病菌的种类和系统进化关系，为其防治及系统进化提供理论依据，采用显微形态学观察、致病性检测、分子生物学检测的方法对其进行鉴定，并构建系统进化树进行分析。结果表明，艾草白粉病菌分生孢子长度平均约为34.57 μm，宽度平均约为18.36 μm，以约3～8个分生孢子串生在分生孢子梗上，附着胞少裂片对生。根据病原菌的rDNA-ITS序列（GenBank登录号为KF056818）建立进化树分析可知其与来自韩国、日本的Golovinomyces artemisiae聚在1支上，登录号分别为KJ136112、AB077654，而与同属的另外1个种亲缘关系较远。分析认为，河南周口地区的艾草白粉病菌为G. artemisiae。

关键词：艾草白粉病菌；分子鉴定；进化树

中图分类号： S435.672文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0178-03

艾草（Atemisia argyi）别称艾蒿，属菊科（Asteraceae）蒿属（Artemisia）植物，全草入药，具有温经、去湿、平喘、利胆、止血、消炎、抗过敏等作用，故药物学家李时珍对艾草推崇有加，并记录在《本草纲目》中。目前，白粉病是艾草的主要病害，叶片、叶柄及茎危害较重，病部生有或薄或厚的白色无定形斑片，严重时可致整个植株死亡。虽然化学农药对白粉病的防治有一定的作用，但长期使用农药可能会造成农药残留并影响艾草本身的药性，因此难以保证艾草的药用品质。已有学者对艾草白粉病[1-3]进行过研究，在青岛、甘肃、塔里木盆地等的艾草植株上出现蒿白粉病菌，但仅限于对其形态学的研究，至今未发现运用形态学和分子生物学相结合的方法对艾草白粉病菌进行研究的报道。因此，针对在河南周口发现的艾草白粉病菌，对其进行形态学、致病性、分子生物学的研究，以期为艾草白粉病菌系统进化及防治奠定理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

感染白粉病菌的艾草植株取自周口师范学院校园内。

1.2白粉病菌的形态观察

[CM（24]首先采取感病叶片，通过二氨基联苯胺（3，3′-diamino[CM）]〖LM〗benzidine tetrahydrochloride，DAB）和臺盼蓝染色后在显微镜下进行形态观察[4]。同时剪取1 cm×1 cm大小的感病叶片，经真空镀金后，在Quanta 200型扫描电子显微镜的高真空环境下进行观察。参数设置如下：预设驻留时间为6 μs，灯丝电压为25.00 kV。

1.3白粉病菌总DNA的提取、ITS序列的克隆及测序

1.3.1病原菌总DNA的提取总DNA的提取方法参考生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒。

1.3.2ITS序列的克隆及测序ITS序列采用真菌核糖体区段通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行扩增。白粉病菌ITS PCR扩增体系为20 μL：总DNA模板1 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，ddH2O 5 μL，Taq Mix 10 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，38个循环；72 ℃ 5 min。

PCR反应结束后取5 μL PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将所得到的目的条带经胶回收试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]纯化，连接到pMD18-T载体上，再转化至大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR检测阳性菌株后，将其送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析。

1.4ITS序列的系统进化树构建

在NCBI的GenBank数据库中搜素与艾草白粉病菌ITS序列高度同源的序列，下载不同地区的G. artemisiae ITS序列，采用Clustal X（1.83版）进行序列的完全比对，利用MEGA5.0软件中的邻近法（Neighbor-Joining，N-J）生成艾草白粉病菌的系统进化树，用自展法对系统进化树进行检验，自展数为1 000次。

2结果与分析

2.1白粉病菌的形态观察

[JP3]艾草白粉病菌主要侵染叶片正面，也可侵染叶片背面，发病初期叶片表面出现白色无定形斑片，随后逐渐扩大并连成片状白粉斑，即为病原菌分生孢子、分生孢子梗和菌丝体。病菌严重时，白粉斑布满整个叶片，更为严重时可导致整个植株死亡。

将感病叶片经真空镀金后在扫描电镜下进行观察，同时采用DAB和台盼蓝对其染色，在显微镜下进行形态观察，艾草白粉病菌的分生孢子成串且呈椭圆形或柱形，单个分生孢子长度平均约为34.57 μm，宽度平均约为18.36 μm，以约为3～8个分生孢子串生在分生孢子梗上，附着胞少裂片对生（图1）。

2.2病原菌的致病性鉴定

根据科赫氏法则，对病原菌进行致病性检测，收集感病植株上的白粉病菌接种至健康的艾草植株上，15 d后叶片出现白色的粉状物，且与自然状态发病叶片上的症状类似（图2-A）。取发病艾草叶片染色后在显微镜下观察，其特征与自然发病叶片的显微形态观察特征相同（图2-B），因此初步鉴定此病原菌为G. artemisiae。

2.3ITS序列的扩增及分析

本试验通过真菌核糖体ITS区通用引物ITS1和ITS4，以艾草白粉病菌总DNA为模板，PCR扩增艾草白粉病菌核糖体的ITS区，经38个循环后得到553 bp的目的片段（图3）。将ITS序列上传至NCBI的GenBank数据库中，得到艾草白粉病

菌ITS序列的登录号为KF056818。在NCBI中进行BLAST，与其他同源序列比对分析后发现，周口地区艾草白粉病病原菌ITS区段核苷酸编码序列中，1～178位为ITS1区段序列，179～331位为5.8S rDNA全序列，332～493位为ITS2区段序列，494～553位为28S rDNA序列。

2.4系统发育树的构建

在GenBank核酸数据库中，对艾草白粉病菌G. artemisiae进行BLASTn同源序列搜索，构建系统发育进化树，发现目的序列KF056818与来自韩国的青蒿（登录号KJ136112）、日本的杭白菊（登录号AB077654）的白粉病菌亲缘关系最近，聚在1个进化支上；同时与来自美国艾草和日本魁蒿、山地蒿、滨菊上的白粉病菌（登录号分别为AB077659、AB077649、AB769433）均达到99%同源，而与来自阿根廷茜草科蓬子菜上的G. riedlianus（登录号AB769420）亲缘关系最远，同源性仅为93%（图4）。

3讨论

据报道，艾草叶片中含有天然药物活性成分，加工的艾叶具有血管舒张[5]、抑制血小板聚集[6]、抗诱变、抗真菌活性、抗灰霉病等作用[7]。另外，蒿类植物中的黄酮提取物已被证实有抗炎、抗氧化、抗菌等多种功效[8]。在药用植物的生产过程中，病虫害问题已日渐突出，因此掌握药用植物病害的种类及危害情况对于开展防治及深入研究具有极其重要的意义。

在真菌的鉴定过程中，通常采用形态学方法，通过观察真菌的形态大小、形状来进行分类，但此法往往受人为、环境因素影响导致不能准确判断物种之间的进化关系[9]。真菌 rDNA-ITS 序列在进化过程中保守性较强，有助于各种族之间亲缘关系的确定。但更多学者认为，rDNA-ITS序列分析虽有优点，但并不能单独以这种方法鉴定出所有真菌种类，宜采用与传统的形态学鉴定相结合的方法鉴定真菌种类[10]。

本研究利用rDNA-ITS序列在真菌鉴定上的应用，建立系统进化树分析可得，周口地区的艾草白粉病菌与韩国青蒿（KJ136112）、日本杭白菊（AB077654）的白粉病菌同源性均达到99%，但艾草白粉病菌却未能与其寄主为同一属的青蒿聚在同一支，来自日本寄主为魁蒿（AB077659）、山地蒿（AB077649）和立陶宛的中亚苦蒿（AB769430）均为蒿属的不同小种，却未能聚在1支，不同属的青蒿、杭白菊却聚在同一支，因此推测白粉病菌进化与自身小种进化有关。然而刘先宝等学者对海南的野艾蒿白粉病菌进行rDNA-ITS序列鉴定认为，其与菊科黄瓜菜的叉丝单囊壳白粉菌高度同源[11]，这与本研究结果有一定的差异。通过查阅文献发现，白粉病菌虽具有专化性[12-14]，但不一定只侵染某一种特定的植物，如番茄白粉病菌可侵染除茄科以外的葫芦科的部分植物[15-16]，同时地域差异也可能造成白粉病菌的变异。

本研究运用显微形态学和分子生物学相结合的方法，对河南周口地区艾草白粉病菌进行分析鉴定，对河南省艾草白粉病病菌的分类及防治艾草白粉病具有重要的意义。

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