黄花蒿抗疟相关成分及抗氧化活性对施肥方式的响应

罗世琼，石安东，袁玲，黄建国*

(1．西南大学资源环境学院，重庆400716;2．贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550001)

黄花蒿(Artemisia annua)为菊科一年生草本植物，具有清热、解暑、退黄、截虐等功效，用于阴虚发热，署邪发热，疟疾寒热，骨蒸劳热，温邪伤阴，夜热早凉，湿热黄疸等［1］，已临床应用2000多年。黄花蒿的主要化学成分包括萜烯类、黄酮类、香豆素、苯丙酸类和挥发油等［2］。其中，属萜烯类的青蒿素是目前世界上治疗疟疾的首选药物 (世界卫生组织推荐)［3］。青蒿酸是合成青蒿素的前体［4］，具有抗细菌和真菌等活性［5］;青蒿素脱掉1个氧原子形成去氧青蒿素，也具有抗疟活性，但总体降低青蒿素的抗疟药效［6］。黄酮类不仅具有扩张冠状动脉、降血压、防止冠脉粥样硬化、抗癌等作用，临床上用于治疗冠心病和高血压［7］;而且还具有清除自由基，保护细胞，延缓衰老的功效，并与青蒿素起协同抗疟和抗癌的作用［8-9］。因此，黄花蒿可用于人和动物的疾病治疗和保健［2，8］。有研究表明，以黄花蒿作为反刍动物的饲料添加剂，不仅向动物提供所需的纤维素、大量元素、微量元素、氨基酸及维生素等，而且还含有黄酮和抗氧化活性成分［8］，可预防和治疗动物的某些疾病，如肉鸡柔嫩艾美耳球虫病等［10］。

目前，有关施肥对黄花蒿生长和青蒿素含量的影响研究较多。适量施用氮肥促进黄花蒿生长，提高生物产量［11］，增加肥料中的磷钾比例提高青蒿素含量［12］。但是，在黄花蒿栽培过程中，施肥方式对抗疟相关成分的影响及其与抗氧化活性的关系研究甚少，而黄花蒿体内的抗疟相关成分和抗氧化活性与其作用和药效密切相关。为此，论文研究了在不同施肥条件下，黄花蒿的生长、青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素、总黄酮的含量分布和抗氧化活性等，旨在为提高黄花蒿的品质和科学施肥提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料

供试黄花蒿品种为渝青1号(渝品审鉴2009008)，青蒿素含量高达2%，大面积种植于重庆市武陵山区和三峡库区，由重庆市中药研究院李隆云研究员鉴定并提供种子。

供试土壤采自重庆北碚典型、具有代表性黄砂壤，pH 6．5，有机质 18．76 g/kg，全氮 0．77 g/kg，全磷 0．65 g/kg，全钾 13．37 g/kg，碱解氮 39．92 mg/kg，有效磷 9．81 mg/kg，速效钾 240．01 mg/kg。采取土壤后风干，拣去根系和石砾等杂物，过0．5 cm筛备用。

1．2 试验设计

试验于2011年在西南大学农场网室中进行。采用直径×高=30 cm×40 cm的聚乙烯塑料盆，每盆装风干土15．0 kg。适时播种，幼苗株高20 cm左右移栽(5月5日)，每盆1株。设置4种施肥处理:不施肥 (CK);无机肥(CF);有机肥(M);有机无机配施 (CFM)。每处理重复9次，共36盆。参考大田生产实际［12］，每盆均施用2．22 g纯氮，N∶P2O5∶K2O=1∶1∶1，分别由腐熟干基猪粪、尿素、NaH2PO4·2H2O和 K2SO4提供。其中猪粪氮、磷和钾含量分别为24．99，6．57，16．85 g/kg。CFM处理以氮素用量的50%折算，即每盆施有机肥49．59 g，M处理每盆施有机肥99．17 g，CFM和M处理不足的 N、P、K用 CO(NH2)2、NaH2PO4·2H2O和 K2SO4补充。在施肥时，磷、钾肥和有机肥全做基肥，2/3氮肥做基肥，肥土混匀，另1/3氮肥移栽后30 d追施。

1．3 样品采集

在黄花蒿现蕾期分别采集根、茎、叶植株样品，105℃杀青，室内自然阴干，称重，取少量样品经70℃烘干测水分系数，干重乘以水分系数为生物量(产量)，其余样品经粉碎过0．42 mm筛，备测有关项目。

1．4 抗疟相关成分的提取

抗疟成分提取参照Jessing等［13］的方法，略有改动，精密称取250 mg样品粉末，置100 mL磨口带塞三角瓶中，加入25 mL无水乙醇，称重，在25℃下，避光，培养箱中振荡，121 r/min振荡20 h，无水乙醇补足损失重量，过滤，将滤液密封于 －18℃保存，备测 1．5．2、1．5．3 和1．5．4 项。

1．5 测定项目与方法

1．5．1 土壤与肥料基本化学性质测定 土壤、肥料基本理化性质的测定按常规分析方法［14-15］。土壤有机质采用浓硫酸(H2SO4)重铬酸钾(K4CrO4)氧化法;全氮采用凯氏定氮法;全磷采用 NaOH熔融钼锑抗比色法;全钾采用NaOH熔融火焰光度法;速效磷采用0．03 mol/L NH4F和0．025 mol/L HCl联合浸提钼蓝比色法;碱解氮采用1 mol/L NaOH碱解扩散法;土壤速效钾采用1 mol/L乙酸铵(NH4OAc)浸提火焰光度法测定。

1．5．2 青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的分析 参照文献［16］，用 GC－MS分析青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的含量。分析条件，色谱柱:DB-5 MS(30 m×0．25 mm×0．25μm);升温程序:50～220℃ (15℃/min，保持5 min);220～230℃ (15℃ /min，保持10 min)，载气:氦气 (恒流，31．4 cm/s);分流比:10∶1;检测器温度:250℃;离子源温度:250℃，标准品由Sigma公司提供。青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的累积量等于青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的含量乘以生物量(干物重)。

1．5．3 总黄酮测定 根据 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH与黄酮形成络合物的原理，用 Sigma公司提供的芦丁作对照，在510 nm比色测总黄酮含量［1］。将总黄酮的含量乘以黄花蒿干物重为总黄酮的累积量。

1．5．4 抗氧化活性测定 根据抗氧化活性成分能清除 1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-dipheny-l，2-picrylhyrazyl，DPPH)的原理，参照文献测定黄花蒿抗氧化活性［17-18］，用无水乙醇作试剂配制36．4μg/mL的DPPH溶液。在517 nm处分别测定其吸光值。按如下公式计算清除率:清除率(%)={［1－(Ai－Aj)］/A0}×100(Aj是为了消除浸提液颜色的干扰)。式中，Ai为1 mL供试样品与4 mLDPPH溶液的吸光度;A0为4mL DPPH溶液和1 mL 80%乙醇的吸光度;Aj为1 mL供试样品与4 mL 80%乙醇的吸光度。

1．6 数据分析

采用Excel 2007(12．0)软件和SPSS 10．0软件对试验数据进行统计分析，图表中的数据均为9次重复的平均值，采用单因子方差分析(ANOVA)和LSD法检验不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2．1 施肥方式对生物量的影响

图1 施肥对黄花蒿生长的影响Fig．1 Effects of fertilization on biomass of A．annua

图1可见，施肥显著促进黄花蒿生长，提高生物量，与以往的研究结果一致［11-12，19-20］。在施用CF、M和CFM的处理中，单株总生物量分别比不施肥增加了57．4%，91．6%和 92．3%。此外，在各处理之间，根系生物量差异不显著，CFM和M的茎叶生物量显著高于CF，说明施用有机肥的效果优于化肥。因此，在黄花蒿种植实践中，提倡施用有机肥对于促进生长很必要。

2．2 抗疟相关成分含量及累积量对施肥方式的响应

表1是青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素和总黄酮在黄花蒿根、茎、叶中的含量和积累量。

青蒿酸:青蒿酸的含量分布因器官不同而异，叶片最高，其含量和累积量平均分别为 7733．60 mg/kg和 236．67 mg/株;茎其次，分别是 162．88 mg/kg 和 8．76 mg/株;根系最低，仅 79．33 mg/kg 和 1．26 mg/株，说明叶片是青蒿酸合成和储存的主要器官。

施肥显著提高青蒿酸的含量。施肥后，叶片中的青蒿酸含量增加1．21～2．25倍，CFM和M处理显著高于CK;茎中的增加1．10～2．65倍，增幅表现出CFM＞CF＞M的趋势;根系中的增加1．35～2．85倍，增加趋势与茎相同。

表1 施肥方式对黄花蒿各器官抗疟成分含量和积累量的影响Table 1 Influence of fertilization on concentration and accumulation of antimalarial com ponents in different organs of A．annua

不施肥处理青蒿酸的累积量最低，施肥使整株青蒿酸累积量增加2．48～5．94倍。其中，叶片增加2．40～5．71倍;茎增加1．85～5．64倍;根系中的增加1．73～3．13倍;青蒿酸的增幅均以CFM处理最为显著。说明施肥尤其是CFM有利于提高青蒿酸的产量。

去氧青蒿素:在黄花蒿各器官中，去氧青蒿素含量和累积量均为叶片最高，平均值分别是456．98 mg/kg和13．38 mg/株;茎次之，为19．84 mg/kg 和 1．02 mg/株;根系最低，仅为5．07 mg/kg 和0．08 mg/株。由此可见去氧青蒿素主要分配于叶片。

施肥对去氧青蒿素含量的影响因器官不同而异，施肥总体上提高了各器官中的去氧青蒿素含量。与不施肥处理相比，叶片中去氧青蒿素含量提高 1．38～1．25倍;茎中的提高 2．90～3．75倍，根系中的提高 3．58～4．95倍;在CFM和M处理中，叶片和根系中去氧青蒿素含量均显著高于CF。说明施用有机肥有利于提高去氧青蒿素含量。

施肥促进去氧青蒿素累积，整株累积量增加 2．48～4．02倍，其中叶片增加 2．35～3．96倍，茎增加 5．22～7．5倍，根系中增加4．53～5．57倍。整株和叶片中的去氧青蒿素累积量M＞CFM＞CF;根茎中的去氧青蒿素累积量以CFM处理最高。说明施用有机肥有利于提高去氧青蒿素的产量。

青蒿素:在黄花蒿各器官中，青蒿素含量和累积量均以叶片最高，平均值分别为13424．39 mg/kg和394．83 mg/株;茎次之，为 507．00 mg/kg 和 27．24 mg/株;根系最低，仅 77．53 mg/kg 和 1．24 mg/株。说明叶片是青蒿素主要合成和储存器官。

不施肥处理的青蒿素含量最低，施肥后显著提高青蒿素含量，其中叶片中的青蒿素含量提高1．18～1．39倍，茎中提高2．81～3．06倍;根系中增加1．00～2．02倍。各器官的青蒿素含量表现出CFM＞M＞CF的趋势，其中CFM和M差异不显著，但均显著高于CF。说明CFM和M有利于提高黄花蒿的青蒿素含量。

青蒿素累积量因器官不同而异，不施肥最低，施肥后显著提高，整个植株的增幅为2．43～4．01倍，其中叶片为 2．35 ～3．95倍;茎4．27 ～6．15倍;根系1．28 ～2．57 倍。各器官的青蒿素含量表现出M ＞CFM ＞CF，其中CFM和M差异不显著，但显著高于CF。说明施肥尤其是施用有机肥显著提高青蒿素产量。

总黄酮:黄花蒿不同器官的总黄酮含量也不一样。其中，叶片最高，根系次之，茎最低，叶片中的总黄酮含量是根茎的3．64～5．25倍，类似青蒿素。说明黄花蒿叶片是积累或合成黄酮的主要器官。因此，在提取黄花蒿叶片青蒿素的同时也可提取黄酮。

图2 施肥对黄花蒿抗氧化活性的影响Fig．2 Antioxidant activities of A．annua under different fertilization

施肥对总黄酮含量的影响因器官不同而异。施肥总体上对叶片总黄酮含量无显著影响，但显著提高茎中的总黄酮含量，根系总黄酮含量则降低。

施肥显著提高黄花蒿总黄酮积累量，尤以CFM处理最为显著，单株总黄酮积累量分别比不施肥(对照)提高了 72．48%(CFM)、66．90%(M)和54．65%(CF)。因此，黄花蒿种植过程中，施用有机肥及有机无机配施可提高总黄酮的产量。

2．3 抗氧化活性对施肥方式的响应

图2可见，在黄花蒿体内，各器官的乙醇提取液对DPPH·清除率表现为:叶片＞根系＞茎，平均值依次为65．05%，45．15%和40．08%。说明黄花蒿叶片的抗氧化能力最强，显著高于根系和茎，但后二者之间差异不显著。此外，在不施肥的处理中，各器官乙醇提取液对DPPH·清除率最高，施肥后不同程度降低，类似施肥对菊花抗氧化活性成分的影响［21］。在施肥处理中，叶片的抗氧化活性在CFM显著高于CF和M，后二者的差异不显著。

2．4 黄花蒿抗疟相关成分及抗氧化活性的相关性

相关分析表明，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素的含量之间分别呈极显著正相关 (P＜0．01)，但这3种成分与总黄酮及DPPH·清除率无显著相关(表2)。在黄花蒿体内，总黄酮含量与抗氧化活性呈显著正相关，可用回归方程 y=9．2096x+35．447(r=0．4924*，n=36)表示二者的关系，其中y为DPPH·清除率，x为总黄酮含量(表2、图3)。

表2 抗疟相关成分及抗氧化活性的相关性分析(n=36)Table 2 Correlation between antimalarial compounds and antioxidants in A．annua(n=36)

图3 黄花蒿总黄酮与抗氧化活性的回归分析(n=108)Fig．3 Regression analyses of total flavonoids and antioxidant in A．annua(n=108)

3 讨论

采集不同海拔的黄花蒿叶片，用GC－MS均能同时检测到青蒿酸、去氧青蒿素和青蒿素3种抗疟相关成分［16］。论文进一步研究了上述成分、总黄酮和抗氧化活性在植株体内的含量分布，以及施肥对它们的影响。结果表明，在叶片中的青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素、总黄酮含量和抗氧化活性最高，茎次之，根系最低。说明叶片是合成和储存上述成分的主要器官，是药用重要部位。

施肥促进黄花蒿的生长，单株生物产量比不施肥显著增加。在施肥处理中。CFM和M处理的生物量显著高于 CF，类似前人研究结果［11-12，19-20］。同时，施肥显著提高青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素的含量和产量，尽管施肥总体上对叶片总黄酮含量无显著影响，根系总黄酮含量降低，但显著提高黄花蒿生物量，故黄花蒿总黄酮产量仍然显著增加。需要指出的是，CFM和M处理的抗疟成分产量显著高于CF。因此，在人工种植黄花蒿的过程中，施用有机肥可提高抗疟成分产量。此外，相对于其他抗疟成分，黄花蒿的茎含有较高的黄酮，仅次于叶，变化于590．57～814．24 mg/kg之间。目前，对黄花蒿茎的利用较少，往往丢弃在田间地头［22］，建议将其粉碎加入反刍动物的饲料中，有益于动物健康，减少抗生素使用［8］。

在不施肥的处理中，总黄酮含量及DPPH·清除率最高(茎的总黄酮含量除外)，施肥后不同程度降低。其原因可能是在缺肥条件下，黄花蒿产生了一系列应急反应，根系释放出大量的含有酚羟基的黄酮类，活化土壤中的矿质养分，如P，K，Fe等，提高它们的生物有效性［23］。另一方面，有些黄酮成分具有抗菌和杀虫作用，有利于提高黄花蒿植株自身免疫力［24］。

统计分析表明，在黄花蒿植株体内，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素之间分别呈极显著正相关 (P＜0．01)，相关系数分别为0．972＊＊，0．959＊＊和0．998＊＊(n=36)。其原因可解释为它们有共同的生源途径，青蒿酸是青蒿素的合成前体［4］，去氧青蒿素是青蒿素的代谢产物［6］。但是，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素与DPPH·清除率无显著相关，说明这些抗疟成分没有清除DPPH·的作用。在黄花蒿体内，总黄酮含量与DPPH·清除率呈显著正相关，类似菊花体内总黄酮含量与抗氧化活性的关系［21］，说明黄花蒿的总黄酮具有抗氧化活性。黄花蒿含有40多种黄酮类物质，如猫野草酚、猫野草黄素、紫花牡丹素及蒿黄素等。在它们的分子结构中，大多数芳香环上有羟基，由于共轭作用，羟基的电子向芳香环偏转，使之具有较低的氧化还原电位，容易接受电子清除O2－·，产生抗氧化作用，故总黄酮含量与抗氧化活性呈显著正相关［7-8］。

4 结论

在黄花蒿体内，青蒿酸、去氧青蒿素、青蒿素及总黄酮等抗疟成分在叶片中的含量最高，说明叶片是合成和储存这些抗疟成分的主要器官。青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素之间分别呈极显著正相关，总黄酮与DPPH·清除率呈显著正相关。

施肥促进黄花蒿生长，提高青蒿酸、去氧青蒿素和青蒿素等抗疟成分的含量，但总体上对黄酮含量的影响不大，抗氧化活性则有所降低。

施肥显著提高黄花蒿青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素的产量，尤以有机无机配施和施用有机肥最为显著。因此，在集约化种植黄花蒿的过程中，提倡施用有机肥很有必要。

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