VHL基因对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响*

肖 兵 叶敏华 周 旋 吴淼经 韩 磊 康春生 祝新根

胶质瘤是人类最常见的颅脑肿瘤，其恶性程度高，40%胶质母细胞瘤患者生存期不超过1年［1］。因此，研究胶质瘤的发生、发展机制，寻找胶质瘤治疗的新策略和靶点，成为胶质瘤研究领域的一项重要内容。VHL（Von Hippel Lindau）基因作为一种抑癌基因［2］，由Hippel等［3-4］最先发现，与胶质瘤恶性程度密切相关［5-6］。基质金属蛋白酶（MMPs）与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关，其中MMP-2、MMP-9成为肿瘤侵袭机制研究的热点［7］。本研究通过VHL表达质粒转染胶质瘤细胞，上调VHL基因的表达，观测其对U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力的影响，探讨将VHL作为胶质瘤基因治疗靶点的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

U251胶质瘤细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，VHL表达质粒为本室保存。Transwell小室购自美国Corning公司；DMEM购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，VHL mRNA引物购自中国Genepharma公司，GAPDH单克隆抗体、山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记、山羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶标记购自中国中杉金桥公司，VHL抗体购自英国Abcam公司，MMP-2、MMP-9抗体购自中国SAB公司，RNA提取试剂Trizol、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 U251胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃5%CO2的条件下常规传代培养。

1.2.2 VHL表达质粒转染U251胶质瘤细胞 取对数生长期的细胞接种于6孔板，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将VHL表达质粒转染入U251胶质瘤细胞，设为空白对照组和转染空载体组，培养箱孵育24 h。

1.2.3 RT-PCR检测VHL mRNA表达水平 提取经转染孵育24 h后细胞总RNA。引物由上海吉玛公司合成，RT-PCR法检测VHL mRNA基因的表达水平。与空白对照组和转染空载体组进行比较。

1.2.4 Western blot检测相关蛋白 提取经VHL表达质粒转染孵育24 h后细胞总蛋白，离心后取上清电泳，完毕后将样品转移至PVDF膜上（膜须甲醇激活），封闭1 h，分别加入VHL、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗（1∶1 000），4℃过夜。漂洗后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，TBST洗膜后用化学发光法（ECL）曝光定影。

1.2.5 Transwell体外侵袭实验 将Matrigel过夜解冻，稀释后的Matrigel涂于细胞生长面。将饥饿12～24 h后的U251胶质瘤细胞制成细胞悬液，用含0.1%FBS的DMEM配养基重悬细胞，将细胞密度调至5×105/cm2。取200 μL细胞悬液加入Transwell上室，含10%FBS的RPMI-1640培养基500 μL加入下室。培养48 h后，擦去Matrigel和上室内细胞，多聚甲醛固定10 min；0.1%结晶紫室温染色10 min，清水漂洗3遍。Transwell小室翻过来底面朝上置显微镜下观察拍照。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移能力 分别将转染VHL质粒组、空白对照组、转染空载体组细胞接种于6孔板中，待其贴壁之后用200 μL枪头垂直于6孔板底部划痕，加入培养基后用倒置相差显微镜记录此时及48 h后细胞的迁移情况。

1.2.7 颅内模型的建立及标本制作 取4～6周龄雌性裸小鼠（本实验经伦理委员会审查批准），取对数生长期U251细胞（用作对照组）及经VHL表达质粒转染后U251细胞常规消化后制成单细胞悬液，小鼠常规腹腔麻醉后消毒备皮，将制成的单细胞悬液利用立体定向仪接种于鼠脑右侧尾状核头部，缝合切口，动物苏醒后放回笼中饲养。细胞接种后第14天将小鼠断头取脑组织，制成切片。

1.2.8 免疫组织化学染色 切片60℃烘烤1 h后常规脱蜡，热修复法行抗原修复，室温冷却后PBS缓冲液洗3次，1%BSA室温封闭，滴加VHL、MMP-2、MMP-9一抗4℃过夜，复温1 h，PBS洗后滴加二抗，37℃孵育30～40 min，PBS洗后滴加三抗，37℃孵育40～60 min，洗后DAB显色，苏木素复染，盐酸分化返蓝后梯度脱水，透明封片，显微镜下拍照。

1.3 统计学分析

使用SPSS 11.5统计软件包处理实验数据，采用单因素方差分析进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测结果

经VHL表达质粒转染U251胶质瘤细胞后，与空白对照组和转染空载体组比较，VHL mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01，图1）。

2.2 Western blot分析结果

Western blot结果表明，U251胶质瘤细胞转染VHL表达质粒组中，VHL蛋白的表达较空白对照组和转染空载体组明显升高；MMP-2的表达较空白对照组和转染空载体组明显降低；MMP-9的表达较空白对照组和转染空载体组明显降低（图2）。

图1 转染VHL表达质粒后U251细胞中VHL mRNA表达水平Figure 1 Expression of VHL mRNA in U251 cells after transfection by VHL expression plasmid

2.3 Transwell体外侵袭实验结果

观察48 h后，U251胶质瘤细胞组中空白对照组和转染空载体组平均视野侵袭细胞数为（58.88±3.93）、（57.63±2.92）个，而转染VHL表达质粒后平均视野侵袭细胞数为（18.81±2.22）个，与空白对照组和转染空载体组比较侵袭能力明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01，图3）。

2.4 划痕实验结果

观察48 h后，计算迁移至划痕区检测视野内的U251细胞总数，空白对照组和转染空载体组分别为（135.20±6.20）个和（127.60±5.53）个，而VHL表达质粒组则为（34.80±5.29）个，与空白对照组和转染空载体比较迁移细胞数量明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.01，图4）。

2.5 免疫组织化学染色结果

VHL、MMP-2、MMP-9阳性信号均定位于细胞质，呈棕褐色染色，发现VHL表达质粒处理组中VHL的表达较对照组明显升高，MMP-2、MMP-9的表达较对照组明显减少（图5）。再次验证VHL表达水平上升后MMP-2、MMP-9表达降低。

图2 转染VHL表达质粒后U251细胞中相关蛋白表达Figure 2 Expression of related protein in U251 cells after transfection by VHL expression plasmid

图3 U251细胞转染VHL表达质粒48 h后Transwell实验结果（×1 000）Figure 3 Results of Transwell experiment 48 h after the transfection of U251 cells by VHL expression plasmid （×1 000）

图4 U251细胞转染VHL表达质粒48 h后划痕实验结果（×200）Figure 4 Results of wound-healing experiment 48 h after transfection of U251 cells by VHL expression plasmid（×200）

图5 不同处理后颅内模型制成的组织切片中VHL、MMP-2、MMP-9表达（×200）Figure 5 The expression of VHL，MMP-2 and MMP-9 in tissue sections from intracranial models with different treatments（×200）

3 讨论

胶质瘤恶性程度高，预后较差［8］，以手术治疗为主，但由于肿瘤浸润性生长，与脑组织间无明显边界，整体疗效仍不理想。随着对胶质瘤发病机制逐渐深入研究，出现了越来越多的基因治疗，如抗血管生成治疗［9］、乏氧肿瘤靶向治疗［10］、RNA干扰治疗［11］等，均取得一定的疗效。

VHL基因定位于3p25～26区［12］，编码213个氨基酸的蛋白质，称为VHL蛋白，是一种重要的肿瘤抑制基因［13-14］，肿瘤发生与VHL基因突变相关，参与多种肿瘤的发生，如肾细胞癌、胰腺癌、中枢神经系统血管瘤、嗜铬细胞瘤等［2］，VHL与胶质瘤的关系主要为VHL可通过参与HIF-1α泛素化降解的过程［15-16］影响VEGF（vascular endothelial growth factor）的表达，而VEGF是胶质瘤发生发展中最为重要的血管形成因子［17］。VHL除了调节HIF-α水平和抗血管生成外，还具有调节细胞周期［18］、细胞凋亡［19］、细胞外基质的作用［20］。孙学英等［21］在抑癌基因VHL治疗实体肿瘤的实验研究中利用脂质体法向小鼠实体肿瘤中注射pcDNA3-VHL基因，能显著抑制实体肿瘤的生长；Chen等［22］将正常的VHL基因转入不表达VHL蛋白的肾癌细胞中，能明显抑制肿瘤细胞的生长。表明VHL可作为胶质瘤基因治疗中一个有效的靶点。

综上所述，本研究利用VHL表达质粒转染U251胶质瘤细胞，上调VHL基因表达，MMP-2、MMP-9表达显著降低，有效降低U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力，为以VHL为靶点的肿瘤基因治疗奠定了基础。

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