激光散斑成像技术在大鼠大脑中动脉栓塞模型侧枝循环观测中的应用

闵喆，李昌盛，方瑜，邱占东，张苏明

激光散斑成像技术在大鼠大脑中动脉栓塞模型侧枝循环观测中的应用

闵喆1，李昌盛2，方瑜1，邱占东1，张苏明1

目的：利用激光散斑成像（LSI）技术观察大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型侧枝循环开放情况及局部脑血流的变化。方法：成年雄性SD大鼠9只，使用改良线栓法制备永久性大脑中动脉栓塞（pMCAO）模型。利用LSI技术观测术后90 min内缺血半球皮质血流变化及侧枝循环开放情况，术后24 h TTC染色法观察脑梗死体积。结果：造模成功后大鼠右侧大脑半球皮质大脑中动脉供血区血流明显减少，部分大鼠随着侧枝循环逐渐开放局部血流不同程度恢复，另一部分大鼠血流恢复缓慢。结论：LSI技术时间空间分辨率高，成像结果直观。

大鼠；大脑中动脉栓塞；激光散斑成像；侧枝循环

缺血性卒中后的脑血流变化是决定预后的重要因素。侧枝循环的开放与建立对卒中后脑血流的代偿与恢复具有十分重要的意义，其病理生理机制还需进一步揭示。大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是目前运用最为广泛的局灶性脑缺血模型[1]，但也存在一些局限性，如能多大程度模拟人类缺血性卒中发病过程，及模型的稳定性和均一性等问题。以往人们在MCAO模型的研究中对于血流变化和侧枝循环情况关注得不够，这也与缺乏良好的观测手段有关。随着激光散斑成像（laser speckle imaging，LSI）技术在血流监测中运用的日趋成熟，使较直观地实时观察脑血流变化成为可能[2]。本研究利用LSI技术观察一种改良的大鼠大脑中动脉永久性栓塞（permanent MCAO，pMCAO）模型侧枝循环开放和局部血流再分布情况，并通过回顾和比较以往的类似研究结果来分析其成像特点和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠9只，体质量240～280 g，购自湖北省实验动物中心。

1.1.2 主要仪器 激光血流成像系统，由华中科技大学国家光电实验室生物医学光子学研究部提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠pMCAO模型的建立 ①颅骨磨薄：参考文献[3]，用微型电钻将位于右侧颅顶部的观察区域颅骨均匀磨薄，不将颅骨磨穿并保持硬脑膜完整，形成一个前至前囟，左至矢状缝，右至右侧颞线，后至冠状缝的近似矩形的观测窗（图1）。②pMCAO模型制备：颅骨观测窗磨薄完成后立即开始造模，参照文献[4]的线栓法并加以改良，采用头端均匀包裹硅橡胶的钓鱼线作为栓子制备大鼠右侧pMCAO模型，过程中使用反馈式动物体温维持仪将大鼠直肠温度控制在（37.0±0.5）℃。

1.2.2 LSI分别于造模前、造模后15 min及造模后90 min在LSI系统下观察血流及侧枝循环情况。观测过程中将激光均匀照射在观测区域上，观测区域的散射光信号由连接在体视显微镜上的CCD采集。原始图像通过实时血流运算法[5]处理直接转换为流速信息，每隔20 ms获得一帧原始图像，连续成像150帧，即每隔30 s获取一张脑血流分布图，每个时间点获得15张脑血流分布图进行分析。

1.2.3 TTC染色及梗死体积计算 大鼠造模后24 h断头处死取脑，脑组织在4℃生理盐水中漂洗，－20℃冰冻15 min后作冠状切片，片厚约2 mm，每个脑组织共切8片。将脑片置于pH7.4、0.01 mmol/L PBS配制的1%TTC溶液中，37℃孵育30 min后，10%多聚甲醛固定，数码相机拍摄照片。

2 结果

2.1 大鼠pMCAO模型的皮质血流变化

4只典型造模大鼠（分别命名为鼠A、鼠B、鼠C、鼠D）不同时间点的血流变化情况有相同点（图2），造模后右侧大脑半球皮质血流均出现下降，且以大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）供血区（约为观测区的下2/3区域）下降最明显（图2鼠C）。不同大鼠之间血流变化存在一定差异。造模后15 min血流下降达峰值，90 min时局部血流不同程度恢复，但部分大鼠血流恢复不明显（图2鼠A）。另有1只大鼠造模后血流下降不明显（约为造模前的60%），且90 min时血流恢复到造模前的约80%，提示可能造模失败（图2鼠D）。

图1 颅骨磨薄示意图

2.2 大鼠pMACO模型的侧枝循环

以鼠B为例，在局部放大图像上观察造模后侧枝循环情况（图3）。本研究发现，直到造模后90 min，观测区MCA发出的部分皮质分支结构仍然完整，并未完全塌陷，在“白光图”上仍可见血管结构，但在散斑图像上其血流已几乎陷于停滞（图3，造模后90 min时“白光图”中“O”所示树杈状血管影，在同时期的两种散斑图上已几乎不显影）。此外，由于静脉管径较粗且静脉血颜色较深，因此在“白光图”中静脉（图3中“V”所示血管）显示较为突出，但实际上其血流速度比动脉慢，相比于“白光图”，LSI可较好地反映血流速度的变化。MCAO造模后，大鼠自发开放的侧枝循环主要存在于大脑前动脉（anterior cerebral artery，ACA）与MCA分支之间，二者之间的吻合血管在正常情况下广泛存在，在造模后，一部分吻合支中血流方向发生逆转，由ACA向MCA分支供血[6]（图3中“▲”所示血管）。另一方面，部分由MCA分支发出流向ACA供血区的血管在造模后血流明显下降并最终停滞（图3“O”所示血管）。另一些在造模前未充盈的侧枝则逐步开放（图3“↖”所示血管），本研究中可见造模后15 min即可见侧枝开放，到90 min时随着开放侧枝的增多，MCA供血区的血流得到不同程度恢复。

图2 4只典型造模大鼠（鼠A，鼠B，鼠C和鼠D）不同时间点的皮质血流变化情况

2.3 大鼠pMCAO模型的梗死体积

TTC染色后，正常脑组织染成红色，缺血脑组织呈白色（图4）。本研究的9只造模大鼠中，除栓塞后血流下降不明显且逐渐恢复的1只大鼠（鼠D）完全无梗死灶外，其余8只均出现不同程度的脑梗死，其中6只栓塞侧大脑半球的皮质及皮质下出现较广泛的梗死灶，另有2只大鼠梗死体积较小，仅出现皮质梗死而无皮质下梗死。

图3 鼠B造模后侧枝循环的局部放大图像

图4 大鼠pMCAO模型的梗死体积（TTC染色）

3 讨论

MCAO模型是目前运用最为广泛的脑梗死模型[1]，“血流决定命运”的脑梗死方程式是溶栓等治疗有效的理论基础[7]。LSI技术的产生为直观研究脑梗死后血流变化及侧枝形成机制提供了新的选择。作为目前应用最广泛的缺血性卒中动物模型，MCAO的具体造模方法有很多差异，结合本研究和文献报道，笔者发现不同的栓塞造模方法制作的模型的侧枝循环的特点有所不同。华中科技大学国家光电实验室骆清铭团队采用头端包被赖氨酸的尼龙线作为栓子构建大鼠MCAO模型，并用LSI技术观察造模后180 min的侧枝循环情况，发现15 min时可观察到较多细小侧枝循环的开放，但随着时间的推移，开放的侧枝数量越来越少[8]。本研究采用的是头端较长一段包裹硅橡胶的鱼线作为栓子构建pMCAO模型，同样在造模后15 min就观察到侧枝循环开放，不同的是观察到90 min时开放的侧枝数量较15 min时更多，这种差异可能是由于不同的栓子材料造成的，前者选择的栓子前端较细，随着栓子周围血栓形成血流梗阻逐渐加重；本研究鱼线经过硅橡胶包裹后头端较粗且具有较强弹性，可在第一时间较快阻断血流，可能更接近临床“脑栓塞”。另一方面，在观察时间上，由于麻醉及实验条件限制，为防止长时间成像造成大鼠的血压及血气明显下降，本研究只观测到90 min。在较早之前，Armitage等[9]采用类似介入的方法，利用微导管向大鼠MCA注入其自体血液塑造的凝血栓子，观察造模前、造模后及24 h后的侧枝情况，关注重点是MCA与ACA之间的较大吻合侧枝。由于同样是类栓塞模型，与本研究类似，他们也观察到不同程度的“自发性再灌”现象。而上海交通大学童善保研究团队[10]利用LSI技术发现MCAO模型早期脑血流与最终梗死面积之间存在线性关系，即血流灌注决定梗死灶大小，这一点似乎不言自明，但LSI技术用图像和数据为之提供了较为直观的证据。

与上述研究相似，本研究发现ACA与MCA分支之间的吻合支在MCAO模型初期的侧枝循环中起重要作用。因为新生血管的形成需要较长的时间，MCAO的最初几小时甚至数十小时，侧枝循环主要依靠固有吻合血管的血流再分布来实现。其中一部分较大的吻合支中血流方向发生逆转，由ACA向MCA分支区供血，而另一部分较小分支则出现血流重新分布，其特点为：由MCA区（图3下方）向ACA区（图3上方）发出的树杈状（“Y”字型）吻合支逐渐闭合，而相反方向的（“人”字型）吻合支则逐步开放，这一现象符合血流动力学特点，因为当血流方向发生改变后，前者的血流阻力明显高于后者。

另一方面，MCAO模型的自发再通或再灌现象也不容忽视，较完全的再灌会导致造模失败，若不加控制甚至会影响实验结论的有效性[11]。本研究中也出现了1例自发再通造成的造模失败。再通可能是栓子过细造成的，也可能存在动物血管结构或生理变异的个体差异等原因。无论如何，在利用MCAO模型进行实验的过程中进行血流监测是必要的，而相对于传统的激光多普勒血流仪，LSI技术可更为实时和直观地监测和发现再通现象，便于及时补救（换栓子）或者舍（剔除）。同时，许多不同造模方法的MCAO模型都发现侧枝循环及其他方面的先天性个体差异导致模型的不均一性，但是临床患者的个体差异也是如此，与其过分苛求模型的均一性，不如提高实验设计的科学性，在组内差异较大的情况下，适当提高样本数量有时是必要的。实时监测血流及侧枝循环情况能帮助较快发现造模失败和极端变异个体，提高实验效率，有助于控制实验质量。

LSI技术还存在一些技术限制，如：①大鼠颅骨较厚，若采取去骨瓣开颅窗则成像质量高，但破坏了血脑屏障，可能影响研究结果，而不开颅的颅骨磨薄技术保持了血脑屏障的完整性，但操作难度较大，若观察窗不均匀则影响成像质量，且不利于长时间反复观测。②动物皮质较浅表的血管血流变化较敏感，环境温度、体温、血压及血气控制十分必要，长时间观测时更是如此。③单纯的LSI技术只能判断相对血流速度，无法得出绝对流速值，也不能判断血流方向，要解决这一问题可将成像系统与多普勒测速或双光子活体成像技术相整合[6]。④LSI可较直观地观察皮质血流变化和侧枝情况，但受激光穿透力的影响，无法对深部脑组织血流进行活体观测，可与磁共振功能成像等影像学技术形成互补[12]。但无论如何，LSI无疑是目前最为直观和实时的高分辨率血流观测手段。

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Laser Speckle Contrast Imaging of Collateral Blood Flow during Cerebral Infarction in Rats

Objective:To study the collateral blood flow and focal cerebral blood flow (CBF)in middle cerebral artery occlusion(MCAO)rats by laser speckle imaging(LSI).Methods:A permanent MCAO (pMCAO)model was generated in male SD rats(n=9)by the intraluminal filament technique.LSI was used to measure CBF and collateral blood flow in the ischemic cortical area and MCA territory after 90 min.The brain was stained with TTC to determine the infarct size 24 h later.Results:CBF was decreased in both the hemispheric cortical area and MCA territory in the first 15 min and increased blood flow velocity was observed in some animals later. Conclusion:LSI has high spatial and temporal resolution,and offers visual imaging.

rats;middle cerebral artery occlusion;laser speckle imaging;collateral blood flow

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.03.006

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030 2.湖北医药学院附属太和医院急诊科湖北十堰 442000

2014-01-24

张苏明suming_zhang1@ 163.com