潍坊地区猪链球菌的分离及血清学鉴定

刘建民 孙鹏

试验研究

潍坊地区猪链球菌的分离及血清学鉴定

刘建民 孙鹏

（山东省潍坊市畜牧局 261021） （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊）

通过潍坊地区猪链球菌病的流行病学调查发现，潍坊地区规模化养殖场和散养户猪链球菌病的发生普遍存在，且规模化养殖场的发病率和死亡率较低。通过对分离的猪链球菌的血清学鉴定发现，潍坊地区猪源链球菌血清群同样以D群为主，占调查总数的45%。优势血清型仍为猪链球菌2型，其他常见的还包括SS1型、SS7型、SS9型和14型。为潍坊地区猪链球菌病的防治提供科学的依据和理论支持。

猪 链球菌 流行病学 血清型

猪链球菌病是由多种链球菌感染引起，多呈地方性暴发。由于发病急、死亡率高，给养猪业造成巨大的经济损失[1]。猪感染链球菌后临床症状以脑膜脑炎、败血症、后肢关节炎、心内膜炎及化脓性组织炎为特征。临床调查发现，大多数病例临床上主要表现为关节炎型[2]。

猪链球菌病一年四季均可发生，以冬春季多发，不同年龄均可发病，病猪和病愈带菌猪猪链球菌病病菌是本病的主要传染源，主要经消化道和损伤的皮肤感染。根据感染发病的种类不同，发病率及死亡率不同。不同国家和地区在正常猪体中检出率也不一样，高的达75%，而低的只有3%[3-4]，带菌检出率多数在50%以上[5]。我国自从吴硕显报道首例猪败血型链球菌病以来，广东、福建、四川等省均有本病发生的报道。到目前为止，已有13个省、市(区)相继报道了猪链球菌病，并在华南、西南和华东地区造成大面积流行[6-8]。

随着养猪业的发展，猪链球菌病的危害日趋严重，已成为制约养猪业健康发展的重要疾病之一。为摸清猪链球菌病在潍坊地区的流行状况，掌握发病日龄及饲养管理等因素对猪链球菌病的影响，并制定合理的防制措施提供科学依据，本研究对规模化养猪场和有一定规模的养猪专业户进行了猪链球菌病的流行病学调查。对潍坊地区猪链球菌分离株进行血清学分型，并对分离菌株的地域分布进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪链球菌病门诊病例分析 2010年3月至2013年3月3年间，根据山东畜牧兽医职业学院动物医院门诊资料(猪病)统计分析，送检病猪、死猪均来自潍坊市潍城、寒亭、坊子、青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个生猪养殖大市(县、区)，挑选具有疑似链球菌病症状的病例，共计262个，涉及205个发病猪群。对其临床症状、剖检变化、流行特点等进行分析。

1.1.2 养猪场(户)猪链球菌病发病情况调查 2010年3月至2013年3月，调查8个规模化养猪场、19户散养户的猪链球菌病发病率、死亡率等。

1.1.3 试剂与药品 链球菌乳胶凝集标准诊断试剂盒(批号786536601，法国bioMerieux SA公司生产)；兰氏(Lanc-efield)分群A~G的乳胶诊断试剂；改良马丁氏培养基(购自北京双旋微生物培养基厂)；微量发酵管(上海医学化验所试剂厂生产)；THB液体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)；猪链球菌1-34型和1/2型标准阳性血清(中国动物卫生与流行病学中心)；各种糖发酵培养基，6.5%NaCL高盐肉汤，马尿酸钠等生化培养基均为自行配制，试剂为分析纯。5%绵羊鲜血琼脂培养基为自行配制。

1..1.4 试验动物 体重20~25g小白鼠，清洁级，购自青岛市药检所。

1.2 方法

1.2.1 检测样品的采集 对送检的猪链球菌病病例，迅速采取其淋巴结、脾、肝、脑或关节囊液(关节炎型)等部位病料，保存于-20℃。

1.2.2 细菌分离培养 对链球菌病死猪病料进行涂片，经革兰氏染色后镜检。另外，按照细菌常规方法分离，样品接种于5%绵羊血琼脂平板，放置于37℃恒温培养箱中培养24 h后，挑取绵羊血平板上针尖大小、表面光滑、灰白色、圆形、半透明、边缘整齐的单个菌落进行革兰氏染色。菌体成对、短链、极少长链状的革兰氏阳性菌接种到THB液体培养基中，经培养无杂菌生长者，置4℃冰箱备用，37℃震荡培养过夜。

1.2.3 细菌的生化试验 将60株命名的分离菌纯培养物分别接种于5%乳糖、海藻糖、水杨苷、七叶苷、甘露醇、菊糖、山梨醇等糖发酵培养基，6.5%NaCl高盐肉汤，马尿酸钠等生化培养基中，培育后记录结果。

1.2.4 溶血试验 以平板法(PA)和接触法(CH)测定不同来源的链球菌。（1）PA法：将链球菌接种于5%绵羊鲜血平板，37℃培养48h后观察，菌落周围出现溶血圈者判为溶血阳性。（2）CH法：将链球菌接种于血清肉汤，37℃培养24h，取50μL菌液在“V”，形96孔微量滴定板上倍比稀释后，与等体积1%绵羊红细胞混合，37℃作用1h后观察结果。

1.2.5 动物致病性试验 将分离菌株接种到THB液体培养基中，37℃恒温培养24h后(含菌量约为2.0×108CFU/ ml)。动物试验取分离菌株肉汤培养物，每株分离菌接种2只小鼠，每只腹腔接种0.1ml细菌培养物，同时取2只小鼠作对照，腹腔接种0.1ml生理盐水。对注射后的小鼠分别隔离饲养，连续观察7d。观察其发病及死亡情况，对死亡的及时解剖，无菌采肝脏，脾脏病料，涂片，革兰氏染色，镜检。并在鲜血琼脂平板上划线，分离培养。

1.2.6 兰氏血清分群试验 按链球菌乳胶凝集诊断试剂说明书的方法，将待检分离菌株接种于7%绵羊血脑心汤琼脂培养基，经过37℃培养24h，然后每个菌株选取2~3个菌落接种到含有0.4ml专用提取酶的EP管中，混匀后放37℃温箱中恒温孵育10~15min。将C、D、E、R、S型乳胶混匀后，取1滴滴在反应卡的相应位置，再取消化好的菌液滴1滴于乳胶滴旁作凝集试验，并设PBS空白对照，2 min后判定结果。出现明显的凝集颗粒即为阳性，未出现凝集的为阴性。

1.2.7 血清学型诊断试验 取自行分离的菌株接种于5%绵羊血平板培养物的菌体，用结晶紫染色，然后用常规方法以猪链球菌1-34型和1/2型的标准阳性血清作玻片凝集试验，同时设PBS空白对照。在平片每格分别标上标准阳性血清的编号，每格分别滴加20µL待检抗原；在每一格滴加等量相应的阳性血清；用枪头混匀被检抗原和相应血清，形成直径2mm的液区，轻微晃动，室温下4min内观察结果,出现大颗粒沉淀者判为阳性。对已确定其血清型的菌株按照其地域来源进行分类，确定猪链球菌不同血清型在潍坊地方的分布状况。

1.2.8 统计不同血清型菌株的地域分布状况 对已确定其血清型的菌株按照其地域来源进行分类，确定猪链球菌不同血清型在潍坊地方的分布状况。

2 结果

2.1 潍坊猪场的流行病学调查情况

规模化猪场数和散养户数的年度产仔数、猪链球菌病的发病率、死亡率等情况，详见表1和表2。规模化猪场链球菌病的发病率达1.99%~2.12%，散养户猪场链球菌病的发病率达16.49%~22.91%，两者之间差异极显著(P<0.01)；规模化猪场链球菌病的死亡率达0.23%~ 0.48%，散养户猪场链球菌病的发病率达2.51%~2.81%，两者之间差异极显著(P<0.01)。不同年度之间规模化猪场与散养户猪场链球菌病的发病率、死亡率差异不显著(P>0.05)。

表1 规模化养猪场发生猪链球菌病的情况 (个、头、%)

表2 散养户发生猪链球菌病的情况 (个、头、%)

2.2 细菌分离

对链球菌病死猪淋巴结、脾、肝、脑或关节囊液(关节炎型)等部位病料进行涂片，经革兰氏染色后镜检，可见革兰氏阳性球菌，多呈单个或成对排列，还可见多个相连的短链，偶见长链。无菌挑取5%绵羊血液琼脂平板上典型菌落涂片，再次进行革兰氏染色，可见成对、短链、极少长链状的革兰氏阳性菌。从疑似链球菌病病猪，分离出60株链球菌，败血型、脑膜炎型、关节炎型和其他型病猪分别分离出25、12、15和8株链球菌。

2.3 猪源链球菌分离株来源及分布情况

在262份病例中，对其中比较清楚的病例分离到的60株分离株进行了猪源链球菌临床症状类型分类。结果发现，来自潍坊市潍城区、坊子区、寒亭区，青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个县市猪链球菌病发病猪场，病猪表现为败血型的占41.7%，脑膜炎型的占20%，关节炎型占25%，其他病型占13.3%，分布情况及菌株编号见表3。

表3 猪源链球菌分离株来源分布及编号

2.4 细菌的生化试验

将60个分离菌株分别接种于乳糖、海藻糖、水杨苷、七叶苷、甘露醇、菊糖、山梨醇等糖发酵培养基，6.5%NaCl高盐肉汤，马尿酸钠等生化培养基中，发现这些分离株均能发酵乳糖、海藻糖、水杨苷、七叶苷，不发酵甘露醇、山梨醇，菊糖反应缓慢，NaCl高盐肉汤和马尿酸钠均为阴性。

2.5 溶血试验

溶血试验 PA、CH两种方法检测分离株以及对照株均为溶血阳性，溶血价在4~32之间。

2.6 致病性试验

小鼠于攻毒后24h开始死亡，48h内部分死亡。临床诊断，小鼠精神沉郁，厌食。皮肤有出血点，粪便干燥，小便呈黄褐色。死后剖检可见肝、脾、肾肿大，胸腔积液，心包积液，心肌出血。用肝脏及脾脏涂片，革兰氏染色镜检，发现有大量单个、成对或3~18个左右的短链革兰氏阳性球菌。对照组小鼠未见异常。

2.7 兰氏血清分群鉴定结果

兰氏血清分群鉴定结果表明，来自潍坊市潍城区、坊子区、寒亭区，青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个县市猪源链球菌血清群以兰氏分群R群为主，占调查总数的45%，其次为C群链球菌，占30%，S群3株，D群3株，E群4株，待定5株(见表4)。

表4 60株猪源链球菌分离株兰氏分群鉴定结果

2.8 血清型鉴定结果

来自潍坊市11个县市猪源链球菌血清型SS2型为主，占调查总数的46.67%、SS1占5%、SS7型占8.33%、SS9型8.33%、14型6.67%、待定25.00%，具体数据见表5。

表5 60株猪源链球菌分离株血清型鉴定结果分布

3 讨论

SS在猪群中的感染相当普遍，各种年龄、性别和品种的猪都易感。20世纪60年代，猪链球菌病在我国大面积流行。广东、广西、四川、福建、江苏、安徽等地相继爆发。1976年，四川爆发猪链球菌病导致100多万头猪发病，死亡70多万头。1998~1999年，江苏省南通地区猪群暴发猪链球菌病，发病率26.38%，病死率达47.21%[9]。猪链球菌病给养猪业造成了巨大的经济损失，因此积极开展本病的流行病学调查有着重要的意义。本研究发现，规模化养殖场和散养户猪链球菌发病率均较高。而规模化养殖场的发病率和死亡率均极显著低于散养户，这应该与规模化猪场饲养环境卫生，消毒严格等降低了猪链球菌的感染几率有关。猪链球菌病发生有一定季节性，10月份至次年4月份多发，说明此病的发生与气候有关，且阴冷潮湿的冬春季节是本病的高发季节。而章红兵报道，该病发病没有明显的季节性，一年四季都有发生。但以4~10月份的夏秋季节发病率高，春冬季发病较少。魏明奎等认为，猪链球菌病一年四季均可发生，但以5~11月份发生较多[10]。邹以仁等认为，猪链球菌病的发生一般无非常明显的季节性变化，但调查结果说明，6、7、8月份发病较少，这可能与气候炎热、病原菌生存困难有关。

传统上我国猪链球菌病以C群流行为主，近几年的流行趋势，似正在发生一此转变[11]。1993年，陈永林等发现国内19个省(市、区)猪链球菌以C群占优势，约占72.22%，D群占7.14%，S和R群各占4.76%；E、H、T各占0.79%。2001年，徐涤平等发现湖北、湖南、河南、江西和辽宁等省猪源致病性链球菌C群40株、E群11株、D群8株、R群4株，各占63.49%、17.46%、12.7%和6.35%。2003年，张桂荣发现古林省链球菌D群占45%、C群25%、E群15%和A群5%，兰氏分类法不能分群10%。2005年，马增军等发现河北秦皇岛、唐山等地猪源链球菌以D群为主，其次为C群。2007年，李春玲等发现广东各地猪场链球菌以D群为主，其后依次为C、G和F群，未能定群12株，各血清群菌株分布无明显地域。相似的是，近两年来潍坊市潍城区、坊子区、寒亭区，青州、诸城、安丘、昌邑、寿光、高密、临朐、昌乐11个县市地区猪源链球菌血清群同样以R群为主，占调查总数的45%，其次为C群链球菌，占30%，A群3株，B群4株，待定8株。这与国内传统上的报道以C群为主有些变化，而与国外有些报道相类似，如在美国、加拿大等国，从败血症和脑炎患猪中分离的链球菌主要是D群链球菌的某些血清型，只有少数C群类马链球菌和L群引起心内膜炎和败血症。此外，尽管在国内见有S群或R群的1型或2型猪链球菌致病的报道，但目前发生和流行可能具有一定的地域性。

目前，我国用于该病免疫预防的疫苗仍以C群兽疫链球菌弱毒株为疫苗株的弱毒活疫苗为主，而与当地的猪链球菌病流行菌株血清群并不完全相符，这可能是猪链球菌病不能得到有效控制的主要原因。因此，在对当地猪链球菌病进行血清学调查的基础上，研制针对当地流行菌株血清群(型)的猪链球菌病疫苗为控制该病的有效措施。

[1] 陈永林, 关孚时. 动物病原性链球菌的血清学分群鉴定[J]. 中国兽医杂志, 1993, 19(9): 3-4.

[2] 斯特劳B E, 阿莱尔 S D, 蒙加林 W L, 等主编. 赵德明, 张中秋, 沈建忠主译. 猪病学(第8版)[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2000: 579-589.

[3] Hommez J, Devriese L A, Henrichses J, et al. Identification and characterization of Streptococcus suis[J].Vet. Microbiol., 1986, 11: 349-355.

[4] Torremorell M, Calsamiglia M, Pijoan C. Colonization of sucking pigs by Streptococcus suis with particular reference to pathogenic serotype 2 strains [J]. Can. J. Vet. Res., 1998, 62(1): 21-26.

[5] Mizanu K, Chengappa M M, James G. Isolation and characterization of tempareture sensitive mutants of Streptococcus suis: Efficacy trial of the Mutats Vaccine in mice[J]. Vet. Microbiol., 1990, 22: 249-257.

[6] 耿艳红, 徐军, 王兆山等. 猪链球菌病[J]. 动物医学进展, 2005, 26(9): 101-104.

[7] 余炜烈. 华南地区屠宰猪群中猪链球菌的流行病学调查及地方株的特性研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2007.

[8] 冷和平, 陈磊, 曾俊霞等. 链球菌病对我国当前养猪业的危害及有效防治对策[J]. 中国猪业, 2009, 1: 23-26.

[9] 姚火春, 陈国强, 陆承平. 猪链球菌1998分离株病原特性鉴定[J]. 南京农业大学学报, 1999, 22(2): 67.

[10] 魏明奎, 张梓英. 链球菌与猪链球菌病[J]. 信阳农业高等专科学校学报, 2006, 16(4): 118-120.

[11] Yasushi K, Takaharu Y. A 10 year survey of antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolates from swine in Japan[J]. Veterinary Medicine Science, 2000, 62(5): 1053-1057.

[12] 杨霞, 卢中华, 张红英等. 猪链球菌病病原的生化分群鉴定和药敏试验[J]. 中国畜牧兽医, 2004, 31(4): 32-33.

[13] 常洪涛, 姚雪静, 陈陆等. 河南省致病性猪源链球菌部分微生物学特性及耐药性研究[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(22): 9533-9535, 9545.

[14] 邢娟, 李学瑞, 柳纪, 胡永浩. 甘肃省健康猪群猪链球菌分离株的耐药性检测[J]. 贵州农业科学, 2011,39(2): 128-130.

[15] 郑世军, 杨汉春. 猪病免疫与防治技术[M]. 北京: 北京农业大学出版社, 1995.

[16] 杨鸿, 林奕, 苏子珩等. 珠三角部分地区猪链球菌的药物敏感性调查与分析[J]. 养猪, 2009, 6: 66-67.

[17] 王丽平, 陆承平, 唐家琪. 链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性及耐药表型[J]. 南京农业大学学报, 2004, 27(4): 81-84.

[18] 毕聪明. 猪源性链球菌的耐药性分析[J]. 畜牧与兽医, 2005, 37(4): 41-42.

[10] 闫若潜, 赵明军, 张志凌等. 河南省致病性猪链球菌血清型及耐药性状况调查[J]. 河南畜牧兽医, 2007, 28(5): 25-27.

（2014–01–23）

S852.61+1

A

1007-1733(2014)05-0001-04