CYS3基因的敲除及其对 Saccharomyces cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

刘 丽，张 婵,2,*，梁婧如，王成涛,2,*，赵吉兴

（1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；2.北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；3.山东中惠食品有限公司，山东 惠民 251706）

CYS3基因的敲除及其对 Saccharomyces cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

刘 丽1，张 婵1,2,*，梁婧如1，王成涛1,2,*，赵吉兴3

（1.北京工商大学 北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048；2.北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；3.山东中惠食品有限公司，山东 惠民 251706）

研究胱硫醚γ-裂解酶基因CYS3敲除对S. cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢的影响。将编码胱硫醚-γ-裂解酶的CYS3基因和抗性标记基因Zeocin克隆，构建敲除组件CYS3Δ:Zeocin，醋酸锂法将其转化导入S. cerevisiae S288C表达，构建CYS3基因敲除的工程菌。结果表明：摇瓶发酵120 h时，工程菌S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量分别为0.60 g/L和0.94 g/L，S. cerevisiae C3较野生型S288C的3-甲硫基丙醇生成量降低36.2%。说明CYS3基因敲除对S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇有较大影响，并呈现负调节作用。

酿酒酵母；胱硫醚-γ-裂解酶；基因敲除；3-甲硫基丙醇合成；负调节

3-甲硫基丙醇（又名菠萝醇，methionol）是我国芝麻香型白酒的特征性香味物质，也是葡萄酒、啤酒、威士忌、白兰地、酱油、豆酱、奶酪等多种发酵食品的重要香气组分[1-2]。3-甲硫基丙醇的香气阈值较低，在食品中建议添加量为0.1～10 mg/kg，其风味按浓度变化依次呈现出麦芽香味、香油味和熟土豆味，常用于调配菠萝、柑橘、辣根、番茄、洋葱、猪肉、牛肉、鸡肉、巧克力、酒用香精等多种香精[1-2]。目前，3-甲硫基丙醇的生产方法主要是化学合成[2-3]，尽管化学合成法成本廉价，但存在诸如原料毒性高、合成过程污染大、有毒副产物难于完全去除等问题。微生物转化制备的天然香料，其构型、手性单一，有助于香气品质的提高，是近年来天然香料制备的重要发展方向[3-8]。

Philippe[5]和Landaud[6]等利用13C-核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、气相色谱-质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometer-computer，GC-MS）研究酿酒酵母（S. cerevisiae）的突变株，初步确定了L-蛋氨酸（methionine，L-Met）生成3-甲硫基丙醇的代谢途径和调控酶。L-蛋氨酸首先在氨基转移酶的作用下通过转氨反应生成α-酮-γ-甲硫基-丁酸，然后在脱羧酶作用下脱羧生成3-甲硫基丙醛，最后在还原酶作用下还原生成3-甲硫基丙醇。L-蛋 氨酸在胱硫醚-γ-裂解酶（cystathioninegamma-lyase，EC4.4.1.1，Cys3）作用下转化生成甲硫醇、α-酮丁酸和氨气[9-10]，这是酿酒酵母的L-蛋氨酸分解代谢另一个途径。Rebeille等[11]克隆了拟南芥编码MGL的cDNA，发现拟南芥分解代谢蛋氨酸是去甲硫基反应开始的。Alting等[12]研究认为，Cys3是广泛底物催化活性的酶，在不同生物体中参与不同代谢反应，其作用不尽相同。NCBI数据库资料表明，S. cerevisiae的胱硫醚-γ-裂解酶由CYS3基因编码表达，该酶参与蛋氨酸、半胱氨酸、胱硫醚的分解代谢。Caroline等[13]研究了Oenococcus oeni的Cys3酶参与去硫基团反应，可催化L-蛋氨酸生成甲硫醇、胱硫醚生成丙酮酸、半胱氨酸生成α-酮丁酸等，过量表达该酶基因的工程菌株，其酶活性显著增高，相关产物生成量明显增加。本实验克隆S. cerevisiae S288C的CYS3基因，并与抗性标记基因Zeocin连接，构建敲除组件CYS3Δ:Zeocin，将其转化整合到S288C基因组，构建CYS3基因敲除的S. cerevisiae工程菌，研究探索CYS3基因敲除对L-蛋氨酸分解代谢的调控效应及其3-甲硫基丙醇合成代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C（ATCCR26108TM）、大肠杆菌E. coli TOP10感受态细胞天根生化科技（北京）有限公司；pPICZα A,B,C 本实验室保存。

质粒提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker 北京全式金生物技术有限公司；Prime STARTM DNA Polymerase、限制性内切酶、T4 DNA连接酶 美国Promega公司；酵母提取物、胰蛋白胨 美国Oxoid公司；甲醇（色谱纯） 天津市西华特种试剂厂；3-甲硫基丙醇（分析纯） 美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基

Luria-Bertani（LB）培养基：蛋白胨1 g/100 mL、酵母粉0.5 g/100 mL、氯化钠1 g/100 mL，添加100 μg/mL氨苄青霉素筛选转化子，固体培养基添加1.6 g/100 mL琼脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：蛋白胨2 g/100 mL、酵母粉1 g/100 mL、葡萄糖2 g/100 mL，固体培养基另加1.5 g/100 mL的琼脂粉。添加不同浓度的Zeocin用于筛选酵母转化子。

发酵培养基I[14]：L-蛋氨酸 10 g/L、KH2PO41.24 g/L、K2HPO40.16 g/L，调节pH 5.0，121 ℃灭菌20 min；葡萄糖20 g，溶于0.1 L蒸馏水，0.22 μm滤膜除菌；无氨基酸氮源1.7 g，溶解于0.1 L蒸馏水，0.22 μm滤膜除菌。

1.3 引物设计

本实验所用引物序列如表1所示。

表1 实验所用引物Table 1 The sequences of primers used in this study

1.4 PCR扩增及敲除组件CYS3Δ:Zeocin的构建

对酿酒酵母S. cerevisiae采用酶法破壁[15]后提取其基因组，根据GenBank公布S. cerevisiae的胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3（NM-001178157）序列设计引物，以S. cerevisiae基因组为模板，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增CYS3基因。利用表2的PCR反应体系，总体积为50 μL，反应程序：94 ℃、5 min，94 ℃、30s，54 ℃、40 s，72 ℃、40～80 s，34个循环，72 ℃延伸10 min。利用CYS3基因序列上单一酶切位点SalI和EcoRI将Zeocin基因插入CYS3基因序列中，构建敲除组件CYS3Δ:Zeocin，实现CYS3基因的敲除和Zeocin抗性基因表达。

表2 PCR反应体系Table 2 Components of PCR reaction system

1.5 敲除组件CYS3Δ:Zeocin的构建与鉴定

敲除组件CYS3Δ:Zeocin的构建策略如图1所示。将带有SalⅠ和EcoRI酶切位点的CYS3基因片段，37 ℃过夜双酶切，回收；回收带有SalⅠ和EcoRI酶切位点的Zeocin片段。上述两回收片段经T4 DNA Ligase 于16 ℃连接过夜，连接产物转化于E. coli TOP10 感受态细胞，选取阳性菌落扩增繁殖进行重组质粒提取并测序。以测序正确的阳性转化子质粒为模板，扩增得到敲除组件CYS3Δ:Zeocin片段，用于转化酿酒酵母。

图1 敲除组件CCYYSS33Δ: Zeeoocciinn的构建策略Fig.1 Building strategy of knocking out gene CYS3 CYS3Δ: Zeocin

1.6 敲除组件CYS3Δ:Zeocin转化酿酒酵母

采用LiAc法[16]（Invitrogen公司提供）制作酿酒酵母感受态细胞及敲除组件的转化，Zeocin抗性筛选阳性转化子，获得的转化子经PCR验证。

1.7 阳性转化子及野生菌株的发酵培养

将S. cerevisiae C3、S. cerevisia e S288C分别接种到含YPD液体培养基中，30 ℃、220 r/min活化24 h，转入发酵培养基Ⅰ中发酵。发酵18h后取适量发酵液，以后每隔24 h取1次，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测发酵液中3-甲硫基丙醇含量。

1.8 发酵产物3-甲硫基丙醇的检测

于8 000 r/min离心15 min发酵培养液，上清液于HPLC检测3-甲硫基丙醇[17-18]。采用LC-20A岛津液相色谱仪，检测条件：色谱柱R P-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），V（甲醇）∶V（水）= 40∶60作为流动相，检测波长215 nm，进样量10 μL，流速1.0 mL/min。

1.9 统计分析

所有实验都进行3次重复，数据采用SPSS18.0软件分析，结果以±s表示，组间数据比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3的克隆

图2 PCR扩增CCYYSS33基因 的电泳图谱Fig.2 The electrophoretogram of PCR amplification of gene CYS3

根据GenBank报道，CYS3基因大小为1 184 bp。以S. cerevisiae S288C基因组为模 板，设计引物CYS3-F和CYS3-R，PCR扩增CYS3基因，1%琼脂糖凝胶电泳PCR产物如图2所示，泳道1、2的1 200 bp左右有一条明显扩增带，其大小与文献报道的一致[19]。

2.2 敲除组件中Zeocin基因序列的克隆

图3 PCR扩增Zeeoocciinn基因的电泳图谱Fig.3 The electrophoretogram of PCR amplification of gene Zeocin

采用引物Zeocin-F和Zeocin-R扩增Zeocin基因。图3的Zeocin基因扩增产物电泳条带大小为1 100 bp左右，与预期大小1 128 bp相符，试剂盒回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。

2.3 敲除组件CYS3Δ:Zeocin 的构建及转化

回收片段经T4 DNA Ligase连接过夜，蓝白斑筛选得到阳性转化子，提取阳性菌落测序。以测序正确的阳性转化子质粒为模板，以蓝斑菌为阴性对照，扩增得到敲除组件CYS3Δ:Zeocin片段（图4），并转化导入S. cerevisiae S288C，Zeocin抗性筛选阳性克隆子（图5）。分别提取阳性转化子和野生菌基因组，并设计引物CYS3-F和CYS3-R PCR验证，从阳性转化子S. cerevisiae C3扩增出大小为2 100 bp左右的特异性条带CYS3Δ:Zeocin，野生型基因组条带大小为1 200 bp，与预期相符（图6），说明敲除组件CYS3Δ:Zeocin已转入S. cerevisiae S288C菌株，成功构建了工程菌S. cerevisiae C3。

图4 敲除组件CCYYSS33Δ: Zeeoocciinn的PCRR电泳图谱Fig.4 The electrophoretogram of PCR amplification of CCYYSS33Δ: Zeeoocciinn

图5 5S. cerevissiiaaee CC3阳性转化子的筛选Fig.5 Screening of the positive transformation of S. cerevisiae C3

图6 6S. cerevisiae CC3的PPCCRR验证Fig.6 Validation of S. cerevisiae C3

2.4 CYS3基因敲除对S. cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢及Cys3酶活性的影响

将工程菌S. cerevisiae C3和野生型菌株S. cerevisiae S288C活化后接种于发酵培养基I，摇瓶发酵，定时取样检测。由图7可知，发酵24 h后，S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量趋于稳定；发酵120 h时，S. cerevisiae C3和S. cerevisiae S288C的3-甲硫基丙醇生成量分别为0.60、0.94 g/L，S. cerevisiae C3的目的产物生成量较野生型菌株降低36.2%（P＜0.01）。野生型S. cerevisiae S288C表现出一定的胱硫醚-γ-裂解酶（Cys3）活性，而工程菌C3未检测到Cys3酶活性。

图7 野生型和工程菌株的3-甲硫基丙醇产量比较Fig.7 Comparison of methionol yields between S. cerevisiae S288C and S. cerevisiae C3

3 讨 论

微生物的L-蛋氨酸分解代谢主要由胱硫醚-γ-裂解酶、去甲硫基酶（EC4.4.1.11，methionine gamma-lyase）或其同功酶（cystathionine β-lyase，CBL）催化完成。Lee等[20]发现瑞士乳杆菌在以L-蛋氨酸为底物时，过量表达去甲硫基酶的同功酶基因CBL，构建的工程菌比野生型菌株或CBL缺失突变株产生更多甲硫醇。本课题组前期研究中并未检测出S. cerevisiae S288C的去甲硫基酶活性存在，设计引物也未PCR克隆出其MGL基因，这与Philippe等[5]研究报道一致。

本实验构建了胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3敲除的工程菌S. cerevisiae C3，研究CYS3基因敲除对S. cerevisiae的L-蛋氨酸分解代谢途径的影响。结果表明，敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因CYS3对S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇生物合成代谢有显著性影响，摇瓶发酵120 h时工程菌S. cerevisiae C3的3-甲硫基丙醇产量较野生型S288C降低了36.2%，目的产物3-甲硫基丙醇产量有较大程度的降低，呈现明显负调节作用。这一结果与国外一些相关性研究有一定差异，Knoll等[13]研究了Oenococcus oeni的胱硫醚-γ-裂解酶参与去硫基团反应，过量表达CYS3基因的菌株，其酶活性显著增高，L-蛋氨酸的代谢相关中间产物生成量明显增加。Alting等[12]研究认为，Cys3是广泛底物催化活性的酶，在不同生物体中参与不同代谢反应，其作用不尽相同，Lactococcus lactis裂解酶（β-Lyase）在干酪风味物质形成过程中发挥一定作用，可催化L-蛋氨酸生成甲硫醇、胱硫醚生成丙酮酸、半胱氨酸生成α-酮丁酸等。NCBI数据库资料表明，S. cerevisiae的胱硫醚-γ-裂解酶由CYS3基因编码表达，该酶参与蛋氨酸、半胱氨酸、胱硫醚的分解代谢。本结果是CYS3基因对S. cerevisiae的3-甲硫基丙醇合成代谢呈现负调节效应，推测CYS3基因编码的胱硫醚-γ-裂解酶，可能同时调节多个代谢途径，CYS3基因的敲除可能影响其他代谢途径，导致酿酒酵母正常代谢失调，从而影响了3-甲硫基丙醇合成，其机理有待深入研究。

[1] 孙宝国. 食品添加剂[M]. 北京: 化学工业出版社, 2008: 59-85.

[2] 孙宝国, 何坚. 香料化学与工艺学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2004: 1-125.

[3] 王成涛, 苏伟, 陈钢. 天然食品配料: 生产及应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2010: 50-120.

[4] BURDOCK G A. Fenaroli’s handbook of flavor ingredients[M]. Boca Raton: The Chemical Rubber Company Press, 2004.

[5] PHILIPPE P, OLIVER D. Methionine catabolism in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Yeast, 2006, 6(1): 48-56.

[6] LANDAUD S, HELINCK S, BONNARME P. Formation of volatile sulfur compounds and metabolism of methionine and other sulfur compounds in fermented food[J]. Applied Microbiology andBiotechnology, 2008, 77(6): 1191-1205.

[7] TAN A W, LEE P R, SEOW Y X, et al. Volatile sulphur compounds and pathways of L-methionine catabolism in Williopsis yeasts[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 95(4): 1011-1020.

[8] ETSCHMANN M M, SELL D, SCHRADER J. Production of 2-phenylethanol and 2-phenylethylacetate from L-phenylalanine by coupling whole-cell biocatalysis with organophilic pervaporation[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2005, 92(5): 624-634.

[9] VURALHAN Z, MORAIS M A, TAI S L, et al. Identification and characterization of phenylpyruvate decarboxylase genes in Saccharomyces cerevisiae[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 4534-4541.

[10] EELKO G. TER S, MARCEL T. Pyruvate decarboxylase catalyzes decarboxylation of branched-chain 2-oxo acids but is not essential for fusel alcohol production by Saccharomyces cerevisiae[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 12: 1303-1307.

[11] REBEILLE F, JABRIN S, BLIGNY R, et al. Methionine catabolism in arabidopsis cells is initiated by a gamma-cleavage process and leads to S-methylcysteine and isoleucine syntheses[J]. Proceedings of National Academy of Sciences, 2006, 103: 15687-15692.

[12] ALTING A C, ENGELS W, van SCHALKWIJK, et al. Purification and characterization of cystathionine β-lyase from Lactococcus lactis subsp. cremoris B78 and its possible role in flavor development in cheese[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(11): 4037-4042.

[13] KNOLL C, du TOIT M, SCHNELL S, et al. Cloning and characterisation of a cystathionine β/γ-lyase from two Oenococcus oeni oenological strains[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 89(4): 1051-1060.

[14] ETSCHMANN M M W, KOTTER P, HAUF J, et al. Production of the aroma chemicals 3-(methylthio)-1-propanol and 3-(methylthio)-propylacetate with yeasts[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 80(4): 579-587.

[15] 贾艳萍, 魏群, 赵军. 对酵母细胞酶法破壁的研究[J]. 中国酿造, 2005, 24(9): 11-13.

[16] SCHIESTL R H, GIETZ R D. High effi ciency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier[J]. Current Genetics, 1989, 16(5/6): 339-346.

[17] 侯晟, 赵磊, 杨雪莲, 等. 酿酒酵母SC408 转化3-甲硫基丙醇条件的研究[J]. 北京工商大学学报: 自然科学版, 2011, 29(2): 18-21.

[18] 温明显, 王成涛, 杨雪莲, 等. ARO10基因在Saccharomyces cerevisiae中克隆表达及其对3-甲硫基丙醇合成代谢的影响[J]. 食品与发酵工业, 2012, 38(4): 1-5.

[19] HIRAISHI H, MIYAKE T, ONO B. Transcriptional regulation of Saccharomyces cerevisiae CYS3 encoding cystathionine γ-lyase[J]. Current Genetics, 2008, 53(4): 225-234.

[20] LEE W J, BANAVARA D S, HUGHES J E, et al. Role of cystathionine γ-lyase in catabolism of amino acids to sulfur volatiles by genetic variants of Lactobacillus helveticus CNRZ 32[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73: 3034-3039.

Effects of Knockout of Gene CYS3 on Methionol Anabolism in Saccharomyces cerevisiae

LIU Li1, ZHANG Chan1,2,*, LIANG Jing-ru1, WANG Cheng-tao1,2,*, ZHAO Ji-xing3
(1. Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing 100048, China; 3. Shandong Zhonghui Food Co. Ltd., Huimin 251706, China)

This work studied effects of knockout of gene CYS3 on methionol anabolism in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). A fragment of gene CYS3 and the resistance marker gene Zeocin were cloned and a construct of knockout of gene CYS3 CYS3Δ:Zeocin was built. Using chemical lithium acetate method, the component（CYS3Δ:Zeocin）was introduced into S. cerevisiae S288C and an engineering bacterium with the knockout of gene CYS3 was obtained. The results showed that methionol yields of S. cerevisiae C3and S. cerevisiae S288C were 0.60 g/L and 0.94 g/L in shake fl ask fermentation at 120 h, respectively. Compared to that of S. cerevisiae S288C, the methionol yield of S. cerevisiae C3was decreased by 36.2%. These results suggested that knockout of gene CYS3 had a great infl uence on methionol anabolism, which appeared to play a negatively regulatory role.

S. cerevisiae; cystathioninelyase; gene knockout; methionol anabolism; negative regulatory

Q815

A

1002-6630（2014）05-0139-05

10.7506/spkx1002-6630-201405028

2013-08-17

国家自然科学基金面上项目（31071593）；教育部科学技术研究重点项目（211101）；北京市教委科技面上项目（KM201110011001）

刘丽（1987—），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：457165343@qq.com

*通信作者：张婵（1984—），女，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：zhangchan@th.btbu.edu.cn

王成涛（1969—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：wct5566@163.com