东北黑斑蛙皮肤抗菌肽的分离及抗菌活性检测

■郝 镯 李 楠 王雅丽 蔡玉峰 李树民 刘 全 王承宇 李吉平

（1.中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122；2.吉林农业大学，吉林长春 130118）

饲料添加剂是维持畜禽健康、促进生长、提高家畜肉质品质的重要影响因素，抗生素曾一度作为必需的饲料加剂长期应用于各类饲料中，但是滥用抗生素引起的药物残留及产生的细菌耐药严重危害人类健康[1]。随着人们食品安全意识的加强，迫切要求有一种广谱、安全、高效、无毒的“绿色添加剂”代替抗生素。抗菌肽广泛存在于自然界中，具有广谱的抗菌作用，以及抗病毒、真菌和原虫的作用，且不易产生耐药性[2]，可以代替抗生素添加于饲料中。两栖动物皮肤抗菌肽以其广谱、高效的特性成为研究的热点。本研究以野生东北黑斑蛙为材料，通过对其皮肤分泌物分离、纯化，以期获得抑菌活性较强的抗菌肽，为新型、绿色饲料添加剂的研制与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物与菌种

野生东北黑斑蛙（Rana nigromaculata）100只，其中幼年组50只，体重(5±0.5)g，成年组50只，体重（20.0±0.5）g，采样于吉林省白山市靖宇县。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus,MRSA）、金黄色葡萄球菌（S.aureus ATC29213）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、大肠杆菌（E.coliATC25922）均购于中国国家菌种冷藏中心。

1.1.2 试剂

三氟乙酸（TFA,Sigma)、乙腈（ACN,Merck)均为色谱纯试剂，α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA，ICN），显色剂（TTC，上海威方）。

1.1.3 仪器

高效液相色谱仪（LC-8A，定量环 100 μl，SHIMADZU）、C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，ACE）、高速低温离心机（Eppendorf）、MALDI-TOF/TOF质谱仪（BRUKER）、酶标仪（Thermo）、CO2培养箱（Thermo）、生化培养箱（上海智诚）、96孔细胞培养板（Costar）。……