小肠移植缺血再灌注损伤的防治策略

邹小明 李晓林

小肠移植在各种器官移植中起步最早，成功最晚，也是难度最大的一种器官移植。经过近半个世纪的临床探索，小肠移植在欧美等发达国家已经成为治疗终末期肠功能衰竭最有效的方法[1]。但在我国小肠移植例数少，效果也不理想[2]。影响小肠移植效果的原因，除了感染和排斥这两大难题之外，另一个重要原因是小肠对缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，I/R)最为敏感。目前应用的UW等保存液对小肠的保存效果远不如肝和肾的保存效果，小肠的有效保存时间明显短于肝、肾、胰腺等器官[3]。加上小肠移植手术的冷保存时间较长，因此移植后I/R明显严重影响移植物功能的恢复。

研究表明，I/R对小肠移植的损害主要有以下3点：(1)直接造成肠黏膜结构破坏，对营养物质的吸收能力下降；(2)肠黏膜屏障受损，肠壁通透性增强，肠道细菌移位至肝脏、脾脏等肠外器官，可导致多器官功能不全[4]；(3)再灌注损伤可使肠上皮细胞产生过氧化物、炎症性细胞因子，从而导致全身性炎症反应，加重多器官功能不全[5]。如果I/R严重，即使手术成功，也会因移植小肠功能恢复不良导致移植失败[6]。此外，I/R作为一种非特异性损伤,可以提高移植物免疫原性，加重急慢性排斥反应,从而影响移植物的存活和功能。

针对小肠I/R的可能机制，进行了许多相应的实验研究。多种治疗方法已经成功应用在小肠I/R动物模型上[7]。现将抗小肠I/R策略的进展介绍如下：

一、缺血预处理

小肠IPC研究始于1996年。此后的研究也证实了缺血预处理(ischemic-preconditioning，IPC)对小肠的保护作用。夹闭肠系膜上动脉5～20 min，恢复血流5～15 min后进入下一个循环。不同学者对最佳I/R的结论不一致。有共识的是，一个以上的缺血和再灌注循环是达到保护作用所必需的。但长时间的IPC无保护效应(30 min/15 min)。目前理想的IPC模型(包括缺血时间以及循环次数)尚未建立。

IPC对小肠的保护效果分为两个阶段：(1)早期预适应(early preconditioning)，短暂缺血后立即出现，持续2～3 h；(2)晚期预适应(late preconditioning)，短暂缺血后的12～24 h出现，持续3～4天。早期预适应涉及到特异细胞功能的直接调节，晚期预适应与多种应激基因激活导致蛋白合成有关。

小肠IPC的作用机制目前尚不清楚。IPC的可能相关机制包括：(1)抑制凋亡；(2)减轻脂质过氧化反应；(3)保护肠黏膜屏障；(4)内源性物质信号传导途径；包括一氧化氮(NO)途径、腺苷途径、蛋白激酶途径、血红素氧合酶-1(HO-1)途径等[5]。改善能量代谢、抗氧化应激和抑制凋亡在IPC的小肠保护机制中发挥了重要作用[8-9]。

近年来，药物预适应(Pharmacological preconditioning)被认为是一种有前景的方法。在保护心肌I/R方面取得了良好的效果。即用药物模拟小肠IPC的效应，目前初步呈现出有效性[10]。有学者在肠缺血48小时前静脉注射阿霉素，发现其可显著减轻小肠I/R导致的肺损伤[11]，提示药物诱导IPC在减轻I/R方面具有可行性。

也有缺血后处理(Ischemia postconditioning)的方法，即在长时间缺血再灌注前给予短暂连续的I/R，同样被证实具有肠保护作用[12]。其机制与IPC相似。进一步深入研究缺血后处理的机制也是抗I/R的有效途径。

二、改进小肠保存液

目前认为任何器官保存液均可短时(<8h)，但不能长时(>24h)保存小肠。临床移植及动物实验也证明多数小肠保存液都能有效保存小肠6～8h。动物实验证实，由于小肠组织结构的特殊性，现在用于保存肾、心、肝等的多数标准保存液都不完全适用于小肠[13]。

综合文献报道，最佳的小肠移植保存液应该具备以下要素：(1)粘度低以利于血管灌洗；(2)含氨基酸以提高肠管活力；(3)含非渗透性胶体物质以减轻水肿；(4)含缓冲液以维持内环境稳定。此外，冷保存前应常规进行血管和肠管灌洗。用于小肠的保存液有：缓冲肝素化林格(LR)液、HC-A液、CZ-1液、Euro Collins液、UW液、WMO-1液等，但目前尚未能确定小肠移植的最佳保存液[13]。

研究表明，在保存液中加入以下成分可提高保存效果。(1)谷氨酰胺(glutamine,Gln)：Gln被认为是一种非必需的氨基酸，是肠黏膜重要的能量代谢物质和生物合成的底物，主要参与能量和物质代谢，增强肠黏膜屏障及免疫功能。Gln经肠黏膜代谢后生成谷氨酸,后者是谷胱甘肽合成的必需前体,而谷胱甘肽能抑制氧自由基所致的肠黏膜I/R。外源性Gln占肠道细胞需要量的80%,供应不足可造成体外肠上皮细胞凋亡。(2)甘氨酸：甘氨酸具有抗炎、免疫调节和细胞保护功能。甘氨酸还可能通过减轻细菌移位、抑制氧自由基和炎性细胞因子的激活、抗凋亡等途径保护肠黏膜。在鼠小肠移植模型中，应用20%甘氨酸能够保护肠黏膜，减轻细菌移位，提高动物术后存活率[5]。(3)羟乙基淀粉(HES)：研究证实，HES产生的渗透压可防止灌注液进入间质而导致间质间隙的扩大，有助于毛细血管网在保存期间保持开放状态，以利血管重建后的良好再灌流。

经典的UW液中含有HES。但UW液对小肠的保存效果并不理想。新的临床肝移植研究表明，UW液的高粘度可能与术后缺血性胆管损伤有关[14]。体外研究也表明，UW液在低温下的高凝聚性和结晶化会对移植物造成不利的影响[15]。因此，HES在UW液中究竟发挥了何种作用引起广泛争议。

我们的研究结果表明，低浓度(3%)的HES盐水在大鼠和猪小肠移植物保存中显示出良好的保存效果[16-17]。HES对IRI的保护作用可能是通过下调细胞因子的表达，减少中性粒细胞激活和聚集，阻断多种炎性细胞因子的连锁反应来实现的。

三、调节NO的合成

在体内，NO由NOS催化左旋精氨酸(L-Arginine，L-Arg)，经多步氧化还原反应生成。NOS是内源性NO合成的主要限速酶，它的活性和基因转录水平都直接影响NO的生物合成。目前已知NOS有3种同工酶，神经型NOS(neuronal NOS，nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)和诱生型NOS(inducible NOS，iNOS)。nNOS 和eNOS统称为原生型NOS(constitutive NOS，cNOS)。

肠道中生理浓度的NO具有清除或灭活氧自由基(O2-)、舒张血管平滑肌、减少白细胞粘附、抑制血小板聚集、维持血管壁的通透性、调节胃肠道黏膜的血流量、保护肠黏膜屏障[18]等作用。过量的NO表现出细胞毒作用，可在多方面损伤组织细胞。

我们的研究表明，在大鼠小肠移植I/R过程中，一定程度抑制NO的合成能够明显减轻I/R；过度抑制NO的合成能够加重小肠移植I/R，增加术后早期死亡率[19-21]。说明NO在I/R中起到了细胞毒和细胞保护的双重作用。进一步研究表明，iNOS的激活和cNOS的减弱共同参与了I/R，cNOS减弱导致的生理性NO减少可能是导致I/R更主要的原因[22-23]。目前调节NO抗I/R的方式包括：(1)补充NO前体物质，给药方式包括静脉、吸入以及肠内应用；(2)抑制iNOS的合成。

四、围手术期抗损伤

(一)抗氧化

人体含有许多自然抗氧化剂，但它们在缺血再灌注期间不能发挥作用。许多的动物实验研究表明，抗氧化剂的应用对减少缺血再灌注诱导的组织损伤有帮助。三磷酸腺苷不仅可以在缺血期为组织提供能量,而且可以在再灌注期抑制氧自由基的产生，因此对肠I/R具有治疗作用。十二指肠内灌注抗氧化剂谷胱甘肽、瑞巴匹特(rebamipide)、二甲基亚砜减弱了肠缺血再灌注后肠黏膜凋亡的发生[24]。

抗氧化剂的应用对减轻I/R有帮助。常用的抗氧化剂有：谷胱甘肽、rebamipide、二甲基亚砜、超氧化物岐化酶(SOD)、甘露醇、维生素C、维生素E、己酮可可碱、异博定、丙酮酸等。给药方式包括静脉注射和肠内给药。

(二)抗炎

主要措施包括抗白细胞、细胞因子以及抗补体。

1.抗白细胞：自Romson等人最早发现白细胞参与I/R以来，人们在这方面的研究比较多，机制也比较清楚。在缺血时已有白细胞聚集,数量随缺血时间延长而增加；再灌注期血管内皮细胞和白细胞激活进行性增加。中性粒细胞与血管内皮细胞粘附后进一步激活，自身合成释放多种炎症介质，促进正反馈形成，导致恶性循环。激活的血管内皮细胞和白细胞释放的大量生物活性物质，如自由基、蛋白酶、细胞因子等，不但可改变自身的结构和功能,而且使周围组织细胞受到损伤。

防治措施可通过抑制白细胞的激活、抑制白细胞粘附分子的合成、抑制白细胞内皮粘附，进而减轻肠I/R。

2.抗细胞因子：细胞因子在中性粒细胞依赖性或非依赖性I/R及术后排斥中起十分关键的作用。I/R后循环中TNF-α、IL-6、IL-1、血小板活化因子升高，参与内皮细胞的调节及中性粒细胞集聚，从而介导I/R时组织细胞损伤。TNF-α、IL-1是细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的调控因子，它们的过度表达可促进血管内皮细胞相互作用，加重炎症反应和I/R。

细胞因子在中性粒细胞依赖性或非依赖性I/R起关键作用。通过抑制TNF等炎症介质可减轻缺血再灌注大鼠肠的炎症反应，从而减轻肠黏膜损伤[25]。

3.抗补体：活性补体C5a受体拮抗剂能有效减少肠I/R，抗C5抗体抑制了TNF-α的表达和组织损伤[26]。

五、其他方法

(一)抗能量缺乏

组织缺血时,组织细胞内氧的供应减少或中断，细胞的有氧代谢受到抑制，ATP很快地降解，形成腺苷、次黄嘌呤等。器官再灌注时，钠泵活性的快速恢复需要大量的ATP。加之无氧代谢产生的有毒酸性产物大量累积，导致细胞内酶活性的改变以及维持跨膜离子梯度的能量缺乏，在严重缺血时可使细胞内环境紊乱，甚至细胞死亡。因此，提供足够的ATP可阻止无氧代谢及维持细胞膜的稳定性。

提供能量的方式包括：(1)动脉灌注二磷酸果糖(FDP)，可以增强碳水化合物的利用，改善细胞能量代谢，减轻肠组织损伤[27]；(2)肠腔内持续注入高携氧能力的过氟碳可以保持肠黏膜结构和功能的完整[28]；(3)在缺血期吸入2个标准大气压的氧气。

(二)提高黏膜抵抗力

肠内营养能够保持肠黏膜免疫力以及对细菌的抵抗力。与肠内营养相比，应用肠外营养而使动物肠道处于“饥饿”状态，ICAM-1和P选择素表达增加，从而中性粒细胞被吸引致肠组织中，加重组织损伤[29]。肠内营养可以减少鼠模型的死亡率和远期器官损伤。

(三)提高机体免疫力

肠I/R中释放的大量细胞因子和炎性介质相互作用，可以引起机体的免疫功能失调。肠黏膜屏障的破坏，可以导致细菌和内毒素进入血液循环，引起肠源性感染。因此增加机体对肠I/R的抵抗力，对防治肠I/R具有重要意义。生长激素和胰岛素样生长因子可以增强机体免疫力，抑制全身炎症反应和细胞因子，从而增加创伤动物的生存率[30-31]。

总之，I/R可能是多种因素相互作用、相互影响、共同作用的结果。肠I/R的防治目前还处于动物实验阶段，希望通过基因水平对其病理生理的深入了解，使其预防和治疗措施趋于完善可行，更快应用于临床实践。

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