慢性低氧对大鼠左右心室的功能及TRPC亚家族表达的影响*

陈慧勤，林默君，刘晓如

（1.泉州医学高等专科学校基础医学部，福建泉州362011；2.福建医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，福州350108）

慢性肺源性心脏病（chronic pulmonary heart disease，CPHD）是由肺组织、肺血管或胸廓的慢性病变引起肺组织结构和功能异常，肺血管阻力增加，肺动脉压力增高，使右心室扩张、肥厚伴或不伴右心功能衰竭的心脏病。慢性肺源性心脏病80%～90%由慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）引起，是严重危害人体健康的常见病，受到医学界的广泛重视。慢性肺源性心脏病发病过程中，早期的心肌肥厚可能是心肌细胞对外界的刺激的一种适应性改变，有一定的代偿意义，有利于维持心输出量，但长期的心肌肥厚最终会导致心力衰竭甚至猝死。因此，研究心肌肥厚的发病机制，寻找可行的治疗靶点对治疗COPD具有重要意义。

本研究采用慢性低氧模型模拟慢性肺源性心脏病的发病过程，慢性低氧造模系统性能稳定，根据低氧箱内的氧浓度实时调节氮气灌注的频率和流量，开关低氧箱时，浓度每次都需要重调，确保氧浓度平稳，波动不超过0.2%，可以尽量减少动物的死亡率并且保障造模的稳定性。慢性低氧使得肺小动脉长期处于收缩状态，导致肺循环阻力增加，形成肺动脉高压，长期的后负荷增加便会造成右心室肥大甚至右心衰竭。

以往的研究发现Ca2＋信号在诱导心肌肥大发生发展过程中起到重要作用［1］，肥厚心肌细胞胞浆内Ca2＋处于持续性高水平［2］，且降低细胞内钙离子浓度，能显著抑制心肌细胞肥大［3］。目前的研究表明规范性瞬时感受器电位（canonical transient receptor potential，TRPC）亚家族成员与 Ca2＋内流有关，它能调节细胞内的 Ca2＋浓度，参与细胞的肥大和凋亡［4］。TRPC亚家族有 7种亚型，分别为 TRPC1-7。TRPC通道可能参与了受体操纵的离子通道（receptor-operated calcium channels，ROCC）、钙池操纵的离子通道（store-operated calcium channels，SOCC）和牵张激活性离子通道（stretch-activated calcium channels，SACC）。由于以往关于TRPC亚家族的报道一般是通过诱导左心室心肌肥厚大鼠模型来进行研究的，而慢性低氧诱导的右心室心肌肥厚的模型报道很少，本研究旨在明确慢性低氧诱导的右心室肥厚大鼠模型的心肌细胞上哪些TRPC亚型介导的Ca2＋内流参与了心肌肥厚的发病，并观察慢性低氧3周对左心室功能的影响，从而为临床治疗慢性肺源性心脏病提供新的靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 药品及仪器

试剂包括：逆转录试剂盒（Takara，日本）、Trizol（invitrogen，美国）、ROX（Roche，瑞士），引物（生工生物工程有限公司，上海），RIPA（碧云天，江苏）、PMSF（碧云天，江苏）、化学发光试剂 Novex ECL（Invitrogen，美国），大鼠抗大鼠β-Actin抗体（Abcam，英国），兔抗大鼠TRPC1抗体（Abcam，英国），其余均为市售国产分析纯。

仪器包括：O2浓度分析仪（ProOX-110型，美国BioSpherix公司）、O2浓度探头（E702型，美国 Bio Spherix公司）、压力换能器（YPJ01型，成都仪器厂）、生物信号采集处理系统（RM6240型，成都仪器厂）、冷冻高速离心机（Heraeus公司，德国）、StepOne实时PCR仪（ABI公司，美国）、BIO-RAD Mini Trans-Blot Cell小型转印槽（Bio-Rad公司，美国）、Mini-Protean Tetra电泳槽（Bio-Rad公司，美国）。

1.2 慢性低氧诱导的大鼠模型的建立

健康 SD大鼠，雄性，体重（200±20）g（上海斯莱克实验动物有限公司），共48只，随机分成正常对照组（CON组）和慢性低氧模型组（CH组）（n＝24）。CON组：SD大鼠常压下饲养3周；CH组：在连续的常压低氧箱中饲养3～4周，低氧箱内的空气以氮气和空气混合，以维持氧浓度于10%±0.2%。

1.3 mRVP、mLVP、左／右心室内压变化率（±dp／dtmax）的测定

CON组和 CH组大鼠分别腹腔注射肝素（heparin，50 IU／100 g），5 min后氨基甲酸乙酯（1 g／kg）腹腔麻醉后，从右颈外静脉插管直到右心室，记录大鼠右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）、右心室内压力最大／最小上升速率（right ventricular pressure maximum rate of rise／descent，RV±dp／dtmax）。后从右颈总动脉插管直至左心室，记录左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室内压力最大／最小上升速率（left ventricular pressure maximum rate of rise／descent，LV±dp／dtmax）。

1.4 RVMI、LVMI的测定

左、右心室插管术后，迅速开胸取出心脏。沿房室交界处剪去左右心房及大血管，分离右心室（RV）及左心室（LV）、室间隔（S），用滤纸吸去多余水分，分别称重，计算 RVMI＝RV／（S）和 LVMI＝LV／（S）。

1.5 心室肌组织形态学检测

麻醉大鼠开胸后迅速取出心脏，剪除大血管、心包膜、脂肪组织等，滤纸吸干，取左、右心室心肌靠心尖部组织块，置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色心肌切片，光镜下观察心肌病理改变。

1.6 Real-Time PCR检测 TRPC1／3／4／5／6／7 mRNA表达水平

将约0.1 g左／右心室组织块在液氮中充分研磨后，加入TRIzol试剂，提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度及纯度。按照Takara逆转录试剂盒的说明书进行RT-PCR。用β-actin作为内参考进行实时定量PCR，建立一个10μl PCR反应体系：H2O 4.15μl，ROX 5μl，PCR Forward Primer 0.3μl，PCR Reverse Primer 0.3μl（表 1），cDNA 0.25μl进行PCR的扩增反应：①预变性 95℃10 min（1 cycle），②变性、退火、延伸 95℃ 30 s，60℃ 1 min（40 cycles）。

Tab.1 mRNA primers ofβ-actin and TRPCsubfamily

1.7 Western blot检测TRPC1蛋白表达水平

左、右心室心肌组织用液氮研磨后，加入RIPA细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取40μg总蛋白进行 Western blot实验。12.5%SDSPAGE电泳后行转膜印迹，分别用兔抗大鼠TRPC1抗体或大鼠抗大鼠β-Actin抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国）与膜上的抗原结合，然后用相应的辣根过氧化物酶（HRP）耦联的二抗与其反应，用化学发光试剂Novex ECL（Invitrogen，美国）检测，经压片曝光后显影和定影。采用Phoretix 1D图像分析软件分析各组蛋白表达情况。

1.8 数据分析

采用统计软件Origin 6.1对所得数据进行分析，数据用均数±标准差表示，各组间均数比较采用成组 t检验分析。

2 结果

2.1 慢性低氧对大鼠左、右心室血液动力学、肥厚指数、病理学表现的影响

2.1.1 左右心室血流动力学和心室肥厚程度比较与正常对照组（CON组）相比：CH组平均体循环动脉压（mean systemic arterial pressure，mSAP）无显著差异，CH组的RVSP、RVMI显著升高，右心室内压力最大上升速率（RV＋dp／dtmax）显著增加，右心室内压力最大下降速率（RV-dp／dtmax）显著下降（P＜0.01，表2、表3），提示在本实验条件下慢性低氧3周可成功诱导大鼠形成右心室肥厚，右心室收缩和舒张功能显著增加；LVSP无明显变化，LVMI显著降低；左心室内压力最大上升速率（LV＋dp／dtmax）和左心室内压力最大下降速率（LV-dp／dtmax）没有明显变化（表3、表4）），表明慢性低氧三周不引起左心室肥厚。以上结果表明慢性低氧3周能特异性引起SD大鼠右心室肥厚，并增强了右心室心肌收缩和舒张的功能，而对左心室功能无显著影响。

Tab.2 Hemodynamic parameters of right ventricle（¯x±s，n＝24）

Tab.3 Right／left ventricle hypertrophy index（¯x±s，n＝24）

2.1.2 病理学改变 HE染色可见CON组大鼠左、右心室心肌细胞排列有序，胞核清晰 （图1A、B）。CH组右心室心肌纤维粗大，细胞内肌原纤维数量增多，心肌纤维排列紊乱，细胞核深染，形状不整。CH组左心室未发现明显变化（图1C、D，图1见彩图页Ⅲ）。提示慢性低氧3周能特异性引起右心室增生肥厚，而对左心室无显著影响。

Tab.4 Hemodynamic parameters of left ventricle（¯x±s，n＝16～18）

2.2 慢性低氧对右心室心肌组织 TRPC亚家族mRNA表达的影响

经实时定量RT－PCR检测，SD大鼠右心室TRPC1 mRNA相对表达水平从 1.00±0.28升高至2.46±1.24（P＜0.05，n＝6），而对右心室心肌组织其它TRPC亚型的mRNA表达没有显著影响（图2）。

Fig.2 Relative quantification of TRPCs on right ventricular（¯x±s，n＝6）

2.3 慢性低氧对右心室心肌组织TRPC1蛋白表达的影响

经Western blot免疫印迹法对大鼠右心室心肌组织上TRPC1通道蛋白的表达进行定量分析，用βactin对TRPC1通道蛋白的表达水平进行标准化，CH组SD大鼠右心室TRPC1蛋白相对表达水平从1.00±0.62升高至 CH：2.02±0.47（P＜0.05，n＝4），提示了慢性低氧预处理可以引起大鼠右心室心肌组织的TRPC1蛋白表达显著增加（图3）。

Fig.3 TRPC1 protein expression in right ventricular of CON and CH rats

3 讨论

低氧作为一种应激的因素，可以对全身尤其是心血管系统产生显著影响。慢性低氧一方面可造成血管内皮细胞损伤，释放收缩血管的活性物质增多，使肺血管收缩，血管阻力增加，形成肺动脉高压。另外低氧增强血管活性物质（如内皮素-1，5-HT等）的反应，呈现慢性痉挛和过度肌化状态，致使肺血管细胞外基质重构［5］，右心发挥其代偿功能，以克服肺动脉压升高的阻力而发生右心室肥大。本研究所采用的造模系统性能稳定，根据低氧箱内的氧浓度实时调节氮气灌注的频率和流量。开关低氧箱时，浓度每次都需要重调，确保氧浓度平稳，波动不超过0.2%，尽量减少动物的死亡率并且保障造模的稳定性。

低氧室中饲养大鼠3周，慢性低氧使得大鼠的肺小动脉长期处于收缩状态，导致肺动脉的收缩力增加，形成肺动脉压力增高，继而引起心室肌组织代偿性肥大，右心室心肌组织切片的病理改变也符合大鼠右心室心肌肥大的结论。右心室内血液动力学改变提示右心室的收缩、舒张功能代偿性增强，证明慢性低氧3周大鼠肺动脉高压右心室心肌肥大模型成功建立。同时，比较慢性低氧3周对大鼠左心室的影响，结果提示慢性低氧3周对大鼠的左心室形态和功能无显著影响。以上结果证实：慢性低氧3周诱导大鼠右心室心肌肥大模型成功建立，该造模方法可重复性较好且对左心室无显著影响，对于诱导大鼠右心室心肌肥大有特异性。

目前的很多研究都已经证实在大鼠心肌细胞上能够检测到TRPC亚家族的表达，这与本研究的结果一致，其中TRPC1 mRNA及蛋白的表达水平在CH组中发生显著上调。TRPC1是TRPC亚家族中第一个克隆的也是最短的哺乳类 TRP，与果蝇 TRP有40%左右的同源性，广泛分布于脑、心脏、肾、肺 、骨骼肌、睾丸、卵巢 、唾液腺，少量分布于肝脏和肾上腺［6］。Bush等应用腹主动脉环阻法诱发的心脏肥大的大鼠模型上仅TRPC1表达上调。将乳鼠以内皮素－1、血管紧张素Ⅱ和苯肾上腺素处理后诱导心肌肥厚模型，其原代培养的心肌细胞上TRPC1通道上调，SOCE增强［7］。Seth等用膜片钳技术发现，压力负荷过重时大鼠心肌细胞TRPCl的表达上调，而TRPC1敲除小鼠在压力负荷过重和神经激素刺激下，不会出现心肌肥大［8］。Vindis等发现 5-HT诱导的大鼠心室肥大的心肌细胞上TRPC1表达是上调的，而 siRNA可下调 TRPC1的表达并且能抑制NFAT的激活，并能抑制由5-HT受体引起的心肌肥大［9］。

本研究以慢性低氧诱导的大鼠右心室心肌肥厚模型进行研究，结果提示慢性低氧3周可特异性诱导SD大鼠产生右心室心肌肥厚，上调了编码右心室心肌细胞TRPC1通道蛋白的mRNA和蛋白的表达，提示TRPC1可能参与了心肌肥厚的发生发展，TRPC1有可能成为治疗肺源性心脏病的新靶点。

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［5］ Vieillard-Baron A，Frisdal E，Eddahibi S，et al.Inhibition of matrix metalloproteinases by lung TIMP-1 gene transfer or doxycycline aggravates pulmonary hypertension in rats［J］.Circ Res，2000，87（5）：418-425.

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