EphrinB2 在大鼠短暂性前脑缺血再灌注后对海马神经元的保护作用1）

王 晔，刘乃红，王 锐，杨小荣，李建国，张 策

脑卒中是严重危害人类健康和生命安全的常见难治性疾病，随着人们生活水平的提高，高脂肪、高能量的过量摄入，其发病率呈现逐年上升的趋势，已成为导致人类死亡的三大原因之一。在发病过程中，缺血性脑卒中大约占所有脑卒中的80%，可能与脑缺血再灌注后发生的神经元迟发性死亡密切相关。然而，目前对脑卒中发生后的神经元损伤机制尚未阐明，临床上也无理想的治疗手段［1，2］。脑缺血再灌注后，海马发生特异性病理学改变：CA1区锥体细胞发生迟发性神经元死亡（即脑缺血再灌注2d～3d后光镜下才见到CA1区锥体细胞的死亡），而CA3区的锥体细胞和齿状回颗粒细胞却几乎不受损害。长期以来，认为脑缺血后神经细胞死亡只是一种被动的坏死过程。但是近年的研究发现，主动的细胞凋亡在脑缺血后海马迟发性神经元死亡的发生过程中具有重要作用［3，4］。目前的研究结果一致认为，NMDA 受体的过度异常激活是脑缺血发生引起神经元损伤的主要原因［5，6］。Eph受体是已知最大的受体酪氨酸激酶家族，共16个成员，因最初来源于可分泌促红细胞生成素的人肝癌细胞系而得名。Eph－ephrin系统主要参与机体的发育过程，如细胞迁移，轴突导向、血管形成，特别是神经系统发育过程中神经网络的形成［7］。ephrin激活Eph的“正向”信号传递包括Rho GTPases，MAPK，Src激酶和PI3激酶等多种下游信号通路［8］。其中，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs），包括ERK1／2，JNK 和p38 MAPK，参与神经元存活和凋亡调控过程［9］。其中，细胞外信号调节激酶ERK1／2是将膜受体接收到的信号转换为相应的蛋白功能和基因表达变化信号转导突进中的重要组成部分［10，11］。

目前，关于ephrinB2的报道主要集中在血管的生成，肿瘤重构等方面。在混合培养的原代神经元中发现，由外源性的EphB1／FC激活的ephrinB2放大了通过mGlu1 受体介导的NMDA 兴奋毒作用［12］。然而，在脑缺血再灌注损伤过程中有关ephrinB2的作用未见相关报道。

因此，本研究设想：在脑卒中发生过程中，ephrinB2通过调控NMDA 受体的功能而发挥神经保护作用，而胞外信号激酶ERK1／2通过调节ephrinB2的作用参与脑卒中的发生。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性Wistar大鼠50只，由山西医科大学动物中心提供，体重180g～250g。遵循中华人民共和国卫生部令（第55号）医学实验动物管理实施细则，遵循山西医科大学实验动物管理细则。

1.2 模型的制备 采用改良的四血管夹闭法进行15min短暂前脑缺血，实验中保持大鼠体温37.0℃，缺血后出现惊厥的动物予以排除。再灌注6h、24h或48h后，断头取脑。

1.3 Caspase－3 活性检测 新鲜或冻存的海马组织标本，按1 mg组织加入10μL裂解液的比例进行裂解，置冰上以小型玻璃匀浆器匀浆。于4℃，14 000g离心20min，取上清，用ELISA法测定脑组织裂解物中Caspase－3的活性。蛋白含量标准化校正：（测定孔OD 值－空白孔OD 值）／蛋白含量；以正常组（伪手术组）的活性为1，计算其余各组的相对活性：实验组标准化矫正后OD 值／正常组标准化矫正后OD 值。

1.4 Western－Blot检测 用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶变性电泳（SDS－PAGE）及转膜后，以β－actin为内参，进行各个特异性抗体孵育。经KODAK IS440自显影系统曝光显影，使用KODAK MI软件进行数据处理。

1.5 统计学处理 采用SPSS15.0 分析。数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA），检验水准a＝0.05，P＜0.05 认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 Caspase－3 酶 活 性 的 检 测 提 前 给 予U0126 后 可 以 使Caspase－3酶活性明显降低，缺血再灌注24h组由2.35±0.25下降到1.25±0.13，48h组由1.50±0.10下降到0.86±0.09，（P＜0.05）。

2.2 缺血再灌注后6h、24h、48h各蛋白磷酸化水平的变化与正常对照组相比，提前侧脑室注射p－ERK1／2特异性抑制剂U0126后，p－ERK1／2 的磷酸化水平与实验一相比出现一种大幅 下降的趋势，再灌后6h由（4.07±0.04）下降到（1.39±0.02），24h由（7.59±0.03）下降到（2.31±0.06）、48h由（6.61±0.06）下降到（1.58±0.02），出现了明显的磷酸化抑制作用。同时，海马缺血再灌注后海马CA1 区组织中EphrinB2的表达水平升高，在6h时表达增高，给予U0126 能够降低EphrinB2的表达。再灌注24h后表达从（3.56±0.02）下降到（2.20±0.11），在48h组，表达从（3.05±0.01）下降到（1.47±0.22，P＜0.05）。提前给予U0126抑制了缺血再灌注引起的NMDA 受体的活化，表现为受体亚基活化水平的下降。其中，作为NMDA受体的功能性亚基NR1的磷酸化水平出现了大幅下降，分别由24h的（7.91±0.79）下降到（2.30±0.70），48h的（5.40±0.82）下降到（2.90±0.12），NR2A亚基的磷酸化水平由24h的（3.17±0.32）下降到（2.57±0.04），48h由（6.22±0.76）下降到（1.90±0.18），NR2B亚基的磷酸化水平变化与实验一相比变化不大（P＜0.05）

3 讨 论

本研究结果显示，缺血再灌注后6h时ephrinB2的表达水平即有快速而显著的升高，并且在24h达到表达的高峰，48h其表达水平略微下降，这可能与神经元在48h已经大量死亡有关。ephrinB2参与了脑缺血再灌注后的神经元损伤，并且可能在其中发挥重要的作用。ephrinB2可能通过对NMDA 受体功能的调控来参与脑缺血再灌注后海马神经元的损伤。在四血管夹闭的全脑短暂缺血再灌注模型中，随着ephrinB2表达的快速增高，NMDA 受体的各个活化性亚基也呈现出磷酸化水平的快速增高，包括p－NR1、p－NR2A、p－NR2B，其中p－NR2A 随着再灌注时间持续升高，其他亚基的活化水平均呈现在24h达到表达高峰，在48h开始下降，这可能与神经元在48h已经大量死亡有关。这与以往报道ephrinB2在MEK 过表达的癫痫模型中通过调节NMDA 受体活化来参与癫痫发生的病理过程相一致，但也仅仅是对NR2B的调节。本研究发现，在成年大鼠脑缺血再灌注损伤的模型中，ephrinB2对NMDA 受体NR1、NR2A、NR2B亚基均具有调节作用，进而影响神经元的存活。

本研究显示，在缺血再灌注后p－ERK1／2的水平出现快速的增高，在24h达到了表达高峰，48h开始有略微下降，比结果与Noshita于2002年的研究结果相一致，阻止ERK 的磷酸化可以使脑缺血再灌注引起的细胞凋亡情况得到缓解［13］。本研究发现，p－ERK1／2表达水平的变化与ephrinB2的表达水平具有高度的相关性。在大鼠前脑短暂缺血再灌注的发生过程中，p－ERK1／2通过调节ephrinB2来调控缺血再灌注后海马锥体神经元的死亡。在缺血再灌注之前给予ERK1／2的特异性抑制剂U0126后发现，随着ERK1／2的活化被特异性的抑制，ephrinB2的表达水平呈现了大幅下降趋势。ERK1／2 可能通过与ephrinB2的相互作用来参与到缺血再灌注后海马神经元的损伤过程，并且ephrinB2的表达受到了ERK1／2的活化调控。提前给予ERK1／2的特异性抑制剂后，可以降低缺血再灌注引起的海马CA1区神经元的损伤程度。

本研究首次在前脑缺血再灌注后引起的神经元损伤中研究了p－ERK1／2、ephrinB2、NMDA 受体的相互关系。研究提示受p－ERK1／2调控的ephrinB2在缺血再灌注后CA1 区神经元的损伤中发挥着重要的作用。

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