核桃内种皮多酚提取工艺及其体外抗氧化活性的初步研究

张春梅，陈朝银，赵声兰*，黄再强，樊启猛（.云南中医学院中药学院，云南昆明650500；.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

核桃内种皮多酚提取工艺及其体外抗氧化活性的初步研究

张春梅1，陈朝银2，赵声兰1*，黄再强1，樊启猛1
（1.云南中医学院中药学院，云南昆明650500；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

采用单因素试验和正交试验优化核桃内种皮多酚的回流提取工艺条件，采用清除羟自由基（·OH）、超氧阴离子（·O2-）、过氧化氢（H2O2）评价核桃内种皮多酚的体外抗氧化活性。结果表明，核桃内种皮多酚提取工艺条件：乙醇体积分数45%、液固比60:1 (mL∶g)、提取温度70℃、提取时间60 min。在此条件下，多酚得率为25.05%。核桃内种皮多酚具有显著的清除·OH、·O2-和H2O2的能力，其中，当质量浓度为160 μg/mL时，对·OH的清除率达100%，优于维生素C。

核桃内种皮；多酚；提取工艺；抗氧化活性

核桃仁系胡桃科（Juglandaceae）植物胡桃（Juglans regial.）的成熟种子，《本草纲目》记载，核桃仁具有补气养血、润噪痰、益命门、利三焦等多种功效[1]。核桃仁作为一种传统医食两用的健康食品[2]，越来越受到人们的广泛关注。我国核桃种植资源非常丰富，研究表明，核桃除富含营养价值较高的蛋白质和脂肪酸外，还含有大量的具有降血脂、降胆固醇、防止动脉粥样硬化、延缓衰老等保健功能的多酚、黄酮、VE等[3-4]，核桃仁中对人体有益的多酚类物质主要集中在种皮部分[5]，且核桃内种皮中集中了核桃仁90%以上的抗氧化物质[6]。本研究主要探讨核桃内种皮多酚的回流提取工艺及其提取物的体外抗氧化活性，为核桃内种皮的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃内种皮：产自云南漾濞的新鲜核桃，破壳取仁，趁鲜分离出核桃内种皮，室温条件下自然干燥，粉碎过20目筛。Folin-Ciocalteu试剂：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸对照品：西安开来生物工程有限公司；邻苯三酚、邻二氮菲、碳酸钠、乙醇等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV759S紫外-可见分光光度计：上海精科仪器有限公司；CP214电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；HWS-18电热恒温水浴锅：上海医疗器械五厂。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的建立及多酚的测定[7]

称取0.0050g没食子酸对照品，于50mL容量瓶中用蒸馏水溶解并定容，得100 μg/mL没食子酸标准溶液，临用现配。分别准确吸取上述对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL于10mL具塞试管内，加水补足至1 mL，摇匀，加入5.0 mL 10%的Folin-Ciocalteu试剂，充分摇匀，5 min后加入7.5%碳酸钠溶液4.0 mL，摇匀，25℃条件下避光放置反应1 h，在波长765 nm处测吸光度值。以吸光度值为纵坐标，没食子酸溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

按标准曲线的建立方法，测定供试品溶液的吸光度值，通过没食子酸标准曲线计算样品中的多酚含量（以没食子酸计），多酚得率计算公式如下：

式中：m1为样品中多酚的含量，g；m2为样品质量，g。

1.3.2 核桃内种皮多酚提取工艺的优化[8-9]

1）单因素试验

A温度的选择：精密称取0.2 g干燥的核桃内种皮5份，分别按50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，在乙醇体积分数60%，液固比60∶1（mL∶g），提取时间60 min的条件下浸提2次，合并提取液，用Folin-Ciocalteu比色法测定多酚，研究不同提取温度对多酚提取的影响。

B液固比的选择：精密称取0.2 g干燥的核桃内种皮4份，按上述试验确定的温度，在乙醇体积分数60%的条件下，液固比（mL∶g）分别按40∶1、60∶1、80∶1、100∶1浸提2次，每次60 min，合并滤液，用Folin-Ciocalteu比色法测定多酚，研究不同液固比对多酚提取的影响。

C提取时间的选择：分别精密称取0.2 g干燥的核桃内种皮5份，按乙醇体积分数60%、上述确定的提取温度和液固比，分别提取30 min、60 min、90min、120min、150 min，浸提2次，合并滤液，用Folin-Ciocalteu比色法测定多酚含量，研究不同提取时间对多酚提取的影响。

D乙醇体积分数的选择：分别称取0.2 g干燥的核桃内种皮5份，按上述确定的提取温度、液固比和时间，选择乙醇体积分数分别为40%、45%、60%、75%、90%，浸提2次，合并滤液，用Folin-Ciocalteu比色法测定多酚含量，研究不同乙醇体积分数对多酚提取的影响。

2）提取工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验进行提取工艺的优化。以乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、液固比（C）、提取温度（D）为考察因素，因素与水平见表1。

表1 核桃内种皮多酚提取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polyphenols extraction process optimization from walnut kernel pellicle

1.3.3 核桃内种皮多酚的体外抗氧化活性测定

1）对羟自由基（·OH）的清除作用[10]

采用Fention反应体系，利用邻二氮菲与Fe2+反应生成有色配合物，该配合物在波长536 nm处有最大吸收的原理进行测定。H2O2/Fe体系产生的羟自由基（·OH）氧化邻二氮菲-Fe2+生成邻二氮菲-Fe3+，A536nm值减少，利用待测样品对体系中·OH的清除作用，抑制A536nm减少，进而测定待测样品对·OH的清除作用。

取10 mL具塞试管，以抗坏血酸（VC）为阳性对照，分别依次加入不同浓度核桃内种皮多酚溶液（或等浓度VC溶液）1 mL，1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲，1 mL 0.01%H2O2，37℃保温1 h后，测定A536nm。损伤管和未损伤管不加抑制剂，损伤管含1 mL的H2O2，未损伤管不加H2O2。羟基自由基清除率计算公式：

式中：A0为试剂未损伤吸光度值；A1为试剂损伤管吸光度值；A2为样品未损伤管吸光度值；A3为样品损伤管吸光度值。

2）对超氧自由基（·O2-）的清除作用[11]

采用邻苯三酚自氧化法，取10 mL具塞试管，依次加入50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液1.5 mL，蒸馏水1.5 mL，摇匀，25℃恒温20 min，取出，立即加入25℃预热3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，迅速混匀，在波长325 nm处每隔30 s测定1次吸光度值，计算线性范围内每1 min吸光度的增加值，即邻苯三酚的自氧化速率ΔA对照。按上法在加入邻苯三酚前，先加入一定量的核桃内种皮多酚溶液，测定ΔA样品。超氧自由基清除率计算公式：

式中：ΔA对照为1 min内对照管吸光度的变化值；ΔA样品为1 min内对照管吸光度的变化值。

3）对过氧化氢（H2O2）的清除作用[12]

pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制的H2O2溶液在波长230 nm处有特征吸收，当加入对H2O2有抑制作用的物质时，溶液在波长230nm处的吸光度值减小，测定A230nm可计算对H2O2的清除率。

取10 mL的具塞试管，分别加入以50 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液配制的40 mmol/L H2O2溶液2.4 mL，再加入不同浓度的核桃内种皮多酚溶液（或VC溶液），用水补足至10 mL，混匀，10 min后测量A230nm。试验中以不加样品的H2O2溶液为空白对照，以不加H2O2溶液为样品对照组。H2O2清除率计算公式：

式中：A0为空白对照组的吸光度值；A1为样品组的吸光度值；A2为样品对照组的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按1.3.1方法以吸光度值A为纵坐标，没食子酸质量浓度C为横坐标，测得没食子酸的线性回归方程A=0.011 4C+ 0.018 9，回归系数r=0.999 1，没食子酸在质量浓度为0～80 μg/mL内，质量浓度与吸光度值呈良好的线性关系。2.2核桃内种皮多酚提取工艺单因素试验

2.2.1 温度对核桃内种皮多酚提取得率的影响

乙醇体积分数60%，液固比60∶1（mL∶g），提取时间60 min，提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，提取温度对多酚得率的影响见图1。

图1 提取温度对多酚得率的影响Fig.1 Effect of temperature on polyphenols extraction yield

由图1可知，在试验温度范围内，随着温度增加，核桃内种皮多酚的提取得率呈先增加后降低趋势，温度较低的情况下，多酚得率较低，当温度升高至80℃时，多酚提取率降低，可能是由于温度过高，破坏了核桃内种皮多酚。温度70℃时，多酚得率最高，达24.63%，故采用70℃作为浸提的适宜温度。

2.2.2 液固比对核桃内种皮多酚得率的影响

乙醇体积分数60%，提取温度70℃，时间60 min，液固比分别为40∶1、60∶1、80∶1、100∶1（mL∶g），液固比对多酚得率的影响见图2。

图2 固液比对多酚得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polyphenols extraction yield

由图2可知，随着液固比的增加，核桃内种皮多酚的得率逐渐增加，当液固比为60∶1（mL∶g）时，多酚得率为24.43%；当液固比＞60∶1（mL∶g）时，多酚得率增加不多，故选择60∶1（mL∶g）为最适液固比。

2.2.3 提取时间对核桃内种皮多酚得率的影响

乙醇体积分数60%，提取温度70℃，液固比60∶1（mL∶g），提取时间分别为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，考察时间对多酚得率的影响见图3。

图3 提取时间对多酚得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on polyphenols extraction yield

由图3可知，随着提取时间增加，多酚得率呈先增后减的趋势，提取时间较长，可能导致多酚物质破坏，得率降低。60～120 min多酚得率变化不大，选择60 min为适宜的提取时间。

2.2.4 乙醇体积分数对核桃内种皮多酚得率的影响

提取温度70℃，时间60 min，液固比60∶1（mL∶g），乙醇体积分数分别为40%、45%、60%、75%、90%，乙醇体积分数对多酚得率的影响见图4。

图4 乙醇体积分数对多酚得率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on polyphenols extraction yield

由图4可知，乙醇体积分数为40%～45%时，随乙醇体积分数的增加，多酚提取率增加，当乙醇体积分数45%时，多酚得率为24.52%，乙醇体积分数为45%～60%时，多酚得率趋于平稳。当乙醇体积分数继续升高时，得率反而降低，故选择乙醇体积分数45%。

2.3 核桃内种皮多酚提取工艺正交试验

以乙醇体积分数、提取时间、液固比、提取温度为因素，以多酚得率为考察指标进行正交试验，正交试验结果见表2。

表2 核桃内种皮多酚提取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for polyphenols extraction process optimization from walnut kernel pellicle

由表2可知，各因素的影响大小为提取温度＞乙醇体积分数＞提取时间＞液固比，云南核桃内种皮多酚的最佳提取条件为A1B2C2D1，即乙醇体积分数45%，提取时间60min，液固比60∶1（mL∶g），提取温度70℃。

按最佳提取工艺A1B2C2D1进行验证试验，三次验证试验多酚平均得率为25.05%。

2.4 体外抗氧化试验结果

2.4.1 对·OH的清除作用

由图5可知，核桃内种皮多酚及VC对·OH都具有清除作用，在试验质量浓度范围内，随质量浓度增加，清除率上升，清除率与质量浓度存在一定的量效关系，且核桃内种皮多酚对·OH的清除率优于VC。当核桃内种皮多酚质量浓度为160 μg/mL时，对·OH清除率可达100%。

图5 核桃内种皮多酚对·OH的清除作用Fig.5 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on·OH scavenging activity

2.4.2 对·O2-的清除作用

由图6可知，核桃内种皮多酚对·O2-有一定的清除作用，但核桃内种皮多酚对邻苯三酚自氧化产生的·O2-的清除作用不如VC。

图6 核桃内种皮多酚对·O2-的清除率Fig.6 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on·O2-scavenging activity

2.4.3 对H2O2的清除作用

由图7可知，在所考察的质量浓度（5～35 μg/mL）范围内，核桃内种皮多酚及VC对过氧化氢的清除作用随其质量浓度的增加不断上升，但总的来说，核桃内种皮多酚对H2O2的清除作用不如VC。

图7 核桃内种皮多酚对H2O2的清除作用Fig.7 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on H2O2scavenging activity

3 结论

核桃内种皮含有丰富的多酚类物质，核桃内种皮多酚的最佳提取条件为温度70℃、时间60 min、液固比60∶1（mL∶g）、乙醇体积分数45%，且影响大小为：提取温度＞乙醇体积分数＞提取时间＞液固比，在最佳提取工艺条件下，核桃内种皮多酚得率为25.05%。核桃内种皮多酚具有较强的清除羟自由基、超氧自由基及H2O2的活性，具有较好的开发应用前景。

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Optimization of extraction technology andin vitroantioxidant activities of polyphenols from walnut kernel pellicle

ZHANG Chunmei1,CHEN Chaoyin2,ZHAO Shenglan1*,HUANG Zaiqiang1,FAN Qimeng1

(1.Faculty of Chinese Traditional Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China; 2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Extraction technologyof polyphenols from walnut kernel pellicle was optimized by single-factor and orthogonal experiments.Meanwhile,the in vitroantioxidant activities of polyphenols from walnut kernel pellicle were evaluated by detecting hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·O2-) and hydrogen peroxide(H2O2)scavenging rates.Results showed that the optimized extraction conditions were as follows:ethanol concentration 45%, liquid-solid ratio 60∶1,temperature 70℃,and extraction time 60 min.Under such condition,the polyphenol extraction yield was 25.05%.Antioxidant experiments showed that polyphenols of walnut kernel pellicle had significant scavenging effect on·OH,·O2-and H2O2.When the polyphone concentration was 160 μg/ml,the·OH scavenging rate of polyphenols from walnut kernel pellicle was 100%,which was higher than vitamin C.

walnut kernel pellicle;polyphenols;extraction technology;antioxidant activities

R284.1

A

0254-5071（2014）07-0130-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.030

2014-05-06

科技部科技支撑计划项目（2011BAD46B03、2011BAD46B02）；省科技计划项目（2009EB081、2011AB006）；傣药学、食品科学与工程学科建设项目（30970101808、3027010185）

张春梅（1989-），女，硕士研究生，研究方向为中药资源开发与利用。

*通讯作者：赵声兰（1962-），女，教授，硕士，研究方向为药食资源开发与利用。