大白菜游离小孢子培养技术高效体系的研究

李 菲 张淑江 章时蕃 张 慧 孙日飞* 张振贤

（1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）

游离小孢子培养技术（isolated microspore culture，IMC）是近年来兴起的单倍体培养方法，具有单细胞、单倍体和较高胚胎发生率等优点，可以迅速获得大量纯合的双单倍体植株，为植物育种和基础研究创造了广阔的应用前景。Lichter （1982）首次报道甘蓝型油菜小孢子培养成功获得了小孢子胚状体及其再生植株，推动了十字花科芸薹属蔬菜作物小孢子培养的兴起，芸薹属作物游离小孢子培养技术得到了快速发展（付颖 等，2011；Ferrie & Caswell，2011；顾祥昆 等，2013）。

大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕是原产于我国的重要蔬菜作物，在我国芸薹属蔬菜中种植面积最大、种类最多，在生产中占据十分重要的经济地位，围绕大白菜育种与研究开展的小孢子培养受到了极大重视。近年来，国内外学者针对影响大白菜游离小孢子培养效率的诸多因素进行了广泛的研究，明确了小孢子的发育时期、前期预处理以及供体植株的生长条件、培养基成分等因素均会影响大白菜小孢子培养的胚胎发生率（张凤兰 等，1994；刘凡 等，2001）。目前，通过技术改良，已建立起较为成熟的大白菜小孢子培养体系（李菲 等，2009），成为芸薹属蔬菜游离小孢子培养研究的主要作物之一。

大量研究显示，基因型是决定小孢子胚胎发生能力的主要因素（Ajisaka et al.，1999；Zhang et al.，2003），但与之相关的功能基因的研究还未见新进展。目前，集中进行大群体材料小孢子培养难度较大，缺乏高效、稳定的培养体系。现有的培养体系在小孢子提取环节主要依靠手工挤压，小孢子胚胎诱导效果受人为因素干扰较大，工作效率低，是开展群体材料小孢子培养研究的主要障碍。因此，提高小孢子培养的机械化操作、降低人为干扰、建立高效培养体系，是推动游离小孢子培养研究深入开展的前提。本试验尝试将机械化操作引入大白菜游离小孢子培养体系，利用细胞破碎仪提取小孢子，研究其对小孢子胚胎诱导效果的影响，以期建立高效的大白菜规模化小孢子培养体系，为集中开展大群体小孢子培养、进一步探讨小孢子胚胎发生的相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜课题组选育的大白菜品种吉红82 及#534DH 群体材料和#438 群体材料。2012年12月26日催芽播种于中国农业科学院蔬菜花卉研究所育苗室，进行低温春化处理，2013年3月6日定植于日光温 室，常规栽培管理直至抽薹开花。

1.2 游离小孢子的机械化提取

以吉红82为试材，选取长2～3 mm、小孢子主要处于单核靠边期的花蕾，先用75%酒精浸泡30 s，7%次氯酸钠溶液洗涤15 min，无菌蒸馏水冲洗3 遍；然后加入B5 改良提取液，进行小孢子提取（李菲 等，2009）。

采用细胞破碎仪（TOMY MS-100R）进行小孢子的机械化提取。取50个适期花蕾于5 mL 离心管内，添加B5 改良提取液至5 mL，以直径0.8 cm 的钢珠破碎花蕾。设计破碎转速分别为2 000、2 500、3 000、4 200 r·min-1，破碎时间均为10 s；以人工研磨挤压提取小孢子为对照。花蕾破碎后，用30 μm 无菌微孔纱布过滤至10 mL 离心管内，洗涤离心3次，每次1 000 r·min-1离心5 min，以去除体细胞杂质，收集提取小孢子。

1.3 游离小孢子活力的快速检测

取1 滴大白菜小孢子悬浮液，加入1～2 滴醋酸洋红溶液染色制片，用显微镜进行观察。小孢子呈现深红色表明有生活力，淡红色为无生活力，无色为死亡小孢子（刘绚霞，1998）。每份样品随机观察4个视野，计算小孢子的平均活力。

1.4 游离小孢子培养浓度的快速确定

以#534DH 群体和#438 群体为试材，每份材料分3 组，每组收集40个适期花蕾于5 mL 离心管内，采用细胞破碎仪机械提取小孢子，经过滤、B5改良提取液洗涤，1 500 r·min-1、4 min 离心3次后，分别悬浮于20、25、30 mL NLN-13（蔗糖浓度为13%）培养基，采用血球记数板观察计算小孢子悬浮液浓度。每份样品观察3个视野，计算平均浓度；比较相同花蕾数提取的小孢子悬浮于不同体积培养基的小孢子浓度，从而获得快速确定小孢子培养浓度的方法。

1.5 小孢子诱导胚胎发生的效果比较

以吉红82 为试材，比较人工挤压提取小孢子和采用细胞破碎仪机械提取小孢子培养的胚胎诱导效果。以#534DH 群体和#438 群体为试材，评价机械提取小孢子培养的胚胎诱导效果。

采用NLN-13 培养基悬浮培养分离提取后的小孢子（Sato et al.，1989），小孢子浓度为1×105～3×105个·mL-1，分装于60 mm×15 mm的培养皿中，每皿3 mL，Parafilm 封口后33℃热激诱导24 h，转入25℃暗培养，直至形成不定胚。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对大白菜小孢子提取效率的影响

由图1可见，细胞破碎仪在转速2 000 r·min-1和2 500 r·min-1条件下破碎10 s，均无法有效破碎花蕾；在转速3 000 r·min-1和4 200 r·min-1条件下破碎10 s，破碎效果良好，达到了人工挤压破碎的程度（图2）。相对于人工挤压提取小孢子，利用细胞破碎仪可同时破碎多份材料（图3），且10 s即可达到良好的破碎效果，而人工挤压提取1 份材料一般需要3～5 min。

醋酸洋红检测结果显示，细胞破碎仪在转速3 000 r·min-1和4 200 r·min-1条件下破碎10 s 提取的小孢子活力与人工挤压提取的小孢子活力差异不显著（表1）；且相同花蕾数提取的小孢子经3次洗涤离心后的提取量与人工挤压的提取量也基本相同 （图4）。

图1 不同转速处理破碎大白菜花蕾效果

图2 机械破碎与人工挤压提取大白菜小孢子的效果比较

图3 机械破碎同时提取多份材料的小孢子

图4 机械破碎的大白菜小孢子提取量与人工挤压的提取量比较

表1 不同提取方法对大白菜吉红82 小孢子活力的影响

2.2 游离小孢子培养浓度的快速确定

从表2可以看出，定容于25 mL或30 mL NLN-13 培养基的大白菜小孢子悬浮液浓度大多数在1×105～3×105个·mL-1之间，符合小孢子培养的浓度要求；而定容于20 mL NLN-13 培养基的大白菜小孢子悬浮液浓度多数偏高，平均浓度与定容于25 mL 或30 mL NLN-13 培养基的大白菜小孢子悬浮液平均浓度差异达极显著水平。考虑试验中在洗涤离心环节存在的操作误差，认为5 mL 离心管收集40个适期花蕾、利用细胞破碎仪提取小孢子定容于25 mL NLN-13 培养基更能稳定满足小孢子培养浓度的要求。

从表2还可以看出，#534DH 群体和#438 群体各材料间小孢子悬浮液浓度差异不显著，说明大白菜小孢子提取机械化操作是可行的。

2.3 小孢子诱导胚胎发生的效果

肉眼观察结果显示（图5），两种方式提取的小孢子均能成功诱导胚胎发生，胚状体数量没有明显差异，说明细胞破碎仪可以取代人工挤压用于大白菜游离小孢子培养的小孢子收集提取。

由图6可见，不同材料单株提取的小孢子诱导胚胎发生存在极显著差异，有的材料未能诱导胚状体生成，如534-1、534-18；有的材料有少量胚状体生成，如534-2、438-66、438-96 等；也有大量出胚的材料，如534-38、438-42（表3）。说明利用细胞破碎仪提取的小孢子进行胚胎诱导，能够客观反映出不同材料间小孢子诱导胚胎发生能力的 差异。

表2 不同NLN-13 培养基定容体积对大白菜小孢子悬浮液浓度的影响

图5 机械破碎提取与人工挤压提取的小孢子诱导胚胎发生的效果

3 结论与讨论

游离小孢子培养技术由于其在胚胎发育学研究、基础研究的群体构建以及育种工作中潜在的应用价值，一直受到广泛关注，但小孢子培养属于组培范畴的细胞培养，大量的外界干扰因素影响了这一技术的高效应用。芸薹属作物小孢子培养相对于其他作物较为成功，特别是甘蓝型油菜、大白菜、甘蓝等作物都已建立较为成熟的培养体系（Shashi et al.，2004）。在供体植株的培养条件上，通过人工气候室栽培创造了较为恒定的栽培条件；精细量化培养基成分，减少了诱导环节的操作误差。但人为干扰因素仍然在很大程度上影响了小孢子培养的可重复性，相同材料在不同人员操作下，如花蕾挤压提取时的挤压力度不同、试验操作的细节差异等都有可能影响后期小孢子诱导胚胎发生的效果。同时，目前的游离小孢子培养仍局限于小规模的试验操作，能够进行大量材料的高效诱导培养是这一技术广泛应用的前提。

图6 机械提取大白菜小孢子胚胎发生情况

表3 不同材料机械提取小孢子诱导胚胎发生情况

本试验尝试用机械提取小孢子替代人工挤压提取，结果显示细胞破碎仪可以很好的替代人工操作，小孢子的提取量及小孢子活力与人工挤压提取无显著差异。一般利用5 mL 离心管收集40～50个适期花蕾，10 s 即可同时均匀破碎6 份材料，提取效率大大超过人工提取。如更换小离心管进行少量小孢子的收集，则可同时进行更多材料的提取。

小孢子培养是单细胞的群体培养，小孢子浓度对胚胎诱导率有一定的影响（申娟 等，2008），但目前要达到小孢子准确的定量培养还有一定难度。现有培养体系，人工挤压提取小孢子，相同花蕾数由于操作中挤压力度不同，小孢子的提取量存在差异，对小孢子的浓度调整一般采用血球计数板计算调整；本试验通过20 份材料的3 组小孢子浓度比较认为，利用细胞破碎仪（TOMY MS-100R）进行小孢子的机械化提取，用力均匀，小孢子提取量较为稳定，从试验操作上简化了浓度调整环节，提高了工作效率。

观察机械提取小孢子诱导胚胎发生的情况，结果显示机械提取小孢子经悬浮培养可正常诱导胚胎发生，可以客观反映材料单株的小孢子胚胎发生能力。值得注意的是，本试验发现在适宜的小孢子培养浓度范围内，小孢子的浓度不是影响胚胎发生的主要因素。如参试材料534-14 的小孢子浓度为90 000个·mL-1，每皿的平均出胚量为14.75个，与534-3 的每皿平均出胚量17.25个无显著差异，而534-3 的小孢子浓度为200 000个·mL-1；534-38 的 小 孢 子 浓 度 为160 000个·mL-1，与534-3的小孢子浓度较为接近，但534-38 的每皿平均出胚量为108.75个，与534-3 的每皿平均出胚量17.25个达到极显著差异。同样，参试材料438-7与438-42 的小孢子浓度分别为70 000个·mL-1和100 000个·mL-1，每皿平均出胚量分别为79.50个和119.75个，都极显著高于小孢子浓度为190 000个·mL-1、每皿平均出胚量为2.25个的438-66。由此可见，大白菜小孢子浓度虽影响小孢子的胚胎诱导率，但小孢子的胚胎发生能力主要取决于材料本身特性。

本试验为建立高效的大白菜游离小孢子培养体系，在国内首次尝试了用机械提取小孢子替代人工挤压方法，在一定程度上消除了人为干扰对试验结果的影响。在简化试验操作、提高试验效率上都有令人满意的结果，这为集中开展大批量试验材料的游离小孢子培养，进行更为深入细致的群体研究提供了更优化的试验平台。本试验结果对大白菜小孢子培养体系是个新的突破，小孢子培养的完全机械化操作是未来发展的趋势。

付颖，杨硕，包美丽，刘雪利，冯辉.2011.小菘菜游离小孢子培养技术研究.中国蔬菜，（8）：51-54.

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