裙带菜多糖的超声波提取及其性质研究

程玲云，黄国清，肖军霞

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

裙带菜多糖的超声波提取及其性质研究

程玲云，黄国清，肖军霞*

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛266109）

采用超声波法提取裙带菜中的多糖，利用苯酚-硫酸比色法测定多糖的含量，研究了提取温度、提取时间、料液比三个因素对多糖提取率的影响，并通过正交实验得出多糖提取的最佳工艺；同时对其理化性质进行初步研究，探讨了温度、pH、硼酸和Ca2+对多糖构象的影响。实验结果表明：裙带菜多糖的最佳提取工艺条件为：料液比1∶45（g/mL）、提取温度80℃、提取时间40min，该条件下裙带菜多糖的提取率达到了7.56%。超声提取得到的裙带菜多糖不含淀粉，但含有少量蛋白质和硫酸基团；温度和硼酸对多糖的构象没有影响，酸和碱对多糖构象产生较小影响，但Ca2+可显著破坏多糖的构象。

裙带菜，多糖，超声波提取

裙带菜（Undaria pinnatifida），一种多年生褐藻，被称为“海藻之王”[1]。裙带菜含有多种营养成分，如褐藻糖胶、褐藻酸钠、膳食纤维等，可以预防和治疗多种疾病，被誉为“海洋中的绿色蔬菜”、“餐桌上的保健食品”[2]。体内外研究证明裙带菜多糖有较高的抗肿瘤活性[3]，并可促进肿瘤细胞凋亡[4]。因此，裙带菜多糖具有广阔的药用前景。

目前多糖提取纯化方法和结构分析已经有较多报道[5-6]。裙带菜多糖（Undaria pinnatifida polysaccharides，UPPS）的提取也有了很多研究。李建等研究得到了超声波提取法较传统酸提法和碱提法得率高、损失小[7]。刘一鹿等研究了多糖提取方法并对其纯度进行鉴定为裙带菜的推广和普及并入治疗肿瘤的药物提供了理论基础[8]。但是国内外对裙带菜多糖的理化性质研究的很少。本文采用提取率较高的超声波提取法来提取裙带菜多糖，研究了提取时间、提取温度和料液比对裙带菜多糖提取率的影响，并探究了pH、温度、硼酸和Ca2+等外界因素对裙带菜多糖溶液紫外吸光光谱的影响，以确定影响多糖构象稳定性的因素。本文对扩大裙带菜多糖的应用范围、促进裙带菜产业的发展具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜裙带菜 青岛市城阳区大润发店；苯酚（AR）、葡萄糖（AR） 天津市巴斯夫化工有限公司；硼酸（AR）、浓硫酸（GR）、盐酸（AR） 莱阳市康德化工有限公司；碳酸氢钠（AR）、氢氧化钠（AR） 天津市大茂化学试剂厂；95%乙醇（AR）、丙酮（AR）、石油醚（AR） 天津市广成化学试剂有限公司。

电热恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱 龙口市先科仪器公司；RE-52B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；电子分析天平 上海奥豪斯公司；KQ-500B超声波清洗器 江苏省昆山市淀山湖镇；UV-2000紫外可见分光光度计、U-V265FW紫外可见记录光谱仪 尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 裙带菜多糖的提取工艺流程 新鲜裙带菜→水洗→烘干→粉碎→超声波提取→过滤得滤液→减压浓缩→95%乙醇醇析→过滤→丙酮、石油醚依次洗涤→烘干→粗多糖产品。

1.2.2 裙带菜多糖含量的测定（苯酚-硫酸法）

1.2.2.1 苯酚溶液的制备 取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集182℃馏分。称取6g，加水溶解，定容于100mL棕色容量瓶。

1.2.2.2 制备标准曲线 取葡萄糖84.00mg定容至1000mL。将该溶液稀释成5.25、10.50、21.00、42.00、84.00μg/mL共5个不同浓度。各吸取1.0mL置于干净试管中，再加入苯酚2.0mL和浓硫酸5.0mL，40℃水浴30min后冷却15min，以蒸馏水作空白，在489nm处测吸光度，绘制标准曲线[9]。

1.2.2.3 裙带菜多糖含量的测定 取粗多糖干品100.0mg，用去离子水定容至100mL，再吸取5.0mL定容液定容至100mL，按1.2.2.2的方法测定裙带菜多糖含量。

1.2.2.4 裙带菜多糖提取率的计算 裙带菜多糖的提取率按下式计算[7]：

式中：W1：干燥的裙带菜的质量（g）；W2：提取粗多糖的质量（g）；W3：用于分析测定的粗多糖质量（g）；V：溶解W3的体积（L）；C1：多糖浓度（g/L）。

1.2.3 裙带菜多糖提取单因素实验

1.2.3.1 提取温度对裙带菜多糖提取率的影响 取5份裙带菜粉分别置于500mL烧杯中，按照料液比1∶45加入去离子水，搅拌均匀于置于40kHz超声波提取频率中在35、50、65、80、95℃下提取20min，提取液经纱布过滤后在旋转蒸发仪上减压浓缩，用95%乙醇沉淀，收集沉淀，真空干燥得到裙带菜粗多糖，计算裙带菜多糖含量和提取率。

1.2.3.2 料液比对裙带菜多糖提取率的影响 取5份裙带菜粉分别置于500mL烧杯中，按料液比1∶30、1∶35、1∶40、1∶45或1∶50加入去离子水，搅拌均匀于置于超声波频率40kHz中于80℃下提取20min，提取液经纱布过滤后在旋转蒸发仪上减压浓缩，采用95%乙醇沉淀，真空干燥得到裙带菜粗多糖，计算裙带菜多糖含量和提取率。

1.2.3.3 提取时间对裙带菜多糖提取率的影响 取5份裙带菜粉分别置于500mL烧杯中，按料液比1∶45加入去离子水，搅拌均匀后置于超声波频率40kHz中于80℃下提取20、30、40、50min，提取液经纱布过滤后在旋转蒸发仪上减压浓缩，采用95%乙醇沉淀，真空干燥得到裙带菜粗多糖，计算裙带菜多糖的含量和提取率。

1.2.4 裙带菜多糖提取正交实验 根据单因素实验结果，选取提取温度、浸提时间、料液比三个因素，采用L9（33）正交实验表[7]进行实验。正交因素水平见表1。

表1 正交因素水平表Table.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.5 裙带菜多糖样品的理化性质

1.2.5.1 外观及溶解性 观察所得裙带菜粗多糖产品的颜色、状态以及气味；称取粗糖产品0.1g共4份，分别放置于装有30mL水、乙醇、丙酮、乙醚的烧杯中，放置1h，观察是否溶解，并测定其水溶液的pH。

1.2.5.2 斐林试剂反应 取试剂甲和试剂乙各2mL，加入裙带菜多糖的水溶液1mL，沸水浴加热10min，观察有无红色沉淀生成，以确定所得多糖是否含有还原糖[10]。

1.2.5.3 碘-碘化钾反应 配制2%碘化钾溶液，然后加入适量碘。取少量多糖于点滴板上，加3～5滴稀碘液，观察颜色变化，确定所得多糖是否含有淀粉。

1.2.5.4 茚三酮反应 取裙带菜多糖溶液1mL，加入0.5mL 0.1%茚三酮溶液，煮沸2min，冷却后观察溶液颜色是否呈紫色，确定所得多糖是否含有蛋白质。

1.2.5.5 硫酸基定性检测 取1mg裙带菜粗多糖产品溶于1mL 1mol/L的盐酸中，沸水加热1h，之后滴加数滴氯化钡，观察是否有白色沉淀出现，确定所得多糖是否含有硫酸基[11]。

1.2.6 紫外吸收特性

1.2.6.1 裙带菜多糖紫外吸收光谱 将裙带菜多糖干品配成浓度为0.5mg/mL的溶液，在190～400nm范围内扫描[12]。

1.2.6.2 外界因素对裙带菜多糖紫外吸收光谱的影响

1.2.6.2.1 温度对裙带菜多糖构象的影响 取三份0.5mg/mL的多糖溶液分别放于20、60、100℃水浴中处理30min，冷却至室温，观察裙带菜粗多糖紫外图谱的变化。

1.2.6.2.2 pH对裙带菜多糖溶液构象的影响 取三份0.5mg/mL的多糖溶液分别调至pH为3、6.5和11后观察裙带菜粗多糖紫外图谱的变化。

1.2.6.2.3 Ca2+对裙带菜多糖溶液构象的影响 取0.5mg/mL的多糖溶液两份，一份加入少许CaCl2，另一份作空白对照，观察裙带菜粗多糖紫外图谱的变化[13]。

1.2.6.2.4 络合物（硼酸）对裙带菜多糖溶液构象的影响 取0.5mg/mL的多糖溶液两份，一份加入稍许硼酸，另一份作空白对照，观察裙带菜粗多糖紫外图谱的变化。

2 结果与分析

2.1 裙带菜多糖提取单因素实验

2.1.1 提取温度对裙带菜多糖提取率的影响 温度是影响多糖提取率的重要因素之一，温度对裙带菜多糖提取率的影响如图1所示。由图1可以看出，随着提取温度的上升，多糖提取量先增加后缓慢减少，当提取温度为80℃时，多糖的提取率最高，当温度继续升高提取率开始缓慢下降。温度的升高可提高多糖溶解度和从裙带菜组织中的渗出速率；但是，当温度升高到一定值时，裙带菜组织中的部分组成成分变性凝固，从而阻止了裙带菜多糖的渗出，因此裙带菜多糖的提取率仅在一定范围内随着温度的升高而增加。

图1 提取温度对裙带菜多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of UPPS

2.2.2 料液比对裙带菜多糖提取率的影响 料液比也是影响裙带菜多糖提取率的重要因素，不同料液比对裙带菜多糖提取率的影响见图2。由图2可以看出，随着溶液量的加大，裙带菜多糖的提取率先增大后减小，当料液比为1∶45时达到最大值。裙带菜干粉有较大的溶胀性，并且存在大量的胶质物质，只有吸收了大量的水分并充分溶胀后多糖才能从组织中渗出，因此在一定范围内，料液比在1∶30～1∶45时，裙带菜多糖的提取率逐渐上升[14]。但是，当料液比在1∶45～1∶50时，反应体系的体积增大，超声液功率一定的情况下裙带带组织受到的剪切力减少，反而使得多糖的提取率有所下降。

图2 料液比对裙带菜多糖提取率的影响Fig.2 Effect of material/water ratio on the yield of UPPS

2.2.3 提取时间对裙带菜多糖提取率的影响 提取时间是影响多糖提取率的一个重要因素，不同提取时间对裙带菜多糖提取率的影响如图3所示。由图3可以看出，提取时间在20～40min之间时，多糖的提取率变化并不大，40min时达到最大值，随着时间的延长，多糖的提取率反而下降。这是由于时间的延长，在超声波较强的机械剪切力的作用下，对多糖有一定的破坏作用[15]；同时随着超声时间的延长，杂质溶出率也随之升高，这也是多糖提取率有所下降的原因之一[16]。

图3 提取时间对裙带菜多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction duration on the yield of UPPS

表2 正交实验结果Table.2 Results of the orthogonal experiment

表3 正交实验方差分析Table.3 Analysis of variance of the orthogonal experiment

2.3 裙带菜多糖提取正交实验

正交实验结果见表2，正交实验的方差分析见表3。由表2极差分析可知，各因素的显著影响顺序为：A＞B＞C，即提取温度＞料液比＞提取时间。由表3的方差分析可知，在显著水平为0.05时提取温度和料液比对裙带菜多糖的提取影响显著，提取时间对裙带菜多糖的提取影响不显著。因此裙带菜多糖提取的最佳工艺条件是A2B2C3；即裙带菜多糖提取的最佳的提取工艺条件为：料液比1∶45，提取温度80℃，提取时间40min，在此条件下，裙带菜多糖的提取率达到了7.56%。

2.4 裙带菜多糖的理化性质

2.4.1 裙带菜粗多糖产品的物理性质 裙带菜粗多糖产品为浅黄褐色的粒状固体，有些许海藻腥味；粗多糖产品易溶于水，但难溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂；其水溶液透明，高浓度时呈粘稠状，其水溶液pH为6.5。

2.4.2 裙带菜粗多糖产品的化学性质 裙带菜粗糖产品的斐林试剂反应无红色沉淀生成，表明该粗多糖为非还原性多糖；硫酸基定性实验出现白色沉淀，说明该粗多糖中有硫酸基团；碘-碘化钾实验为阴性，说明粗多糖中无淀粉；茚三酮反应有紫色出现，说明裙带菜粗多糖产品中存在蛋白质。

2.5 裙带菜多糖的紫外图谱分析

2.5.1 裙带菜多糖溶液的紫外图谱 由图4可以看出，裙带菜多糖在190nm附近有明显的吸收峰，表现为糖的特征吸收；在260nm处无特征吸收，说明裙带菜多糖不含核酸，在280nm附近有吸收峰的出现，说明粗多糖中含有蛋白质，这与茚三酮实验结果相吻合。

图4 裙带菜多糖的紫外光谱Fig.4 UV spectrum of UPPS

2.5.2 环境因素对裙带菜构象的影响

2.5.2.1 温度对裙带菜多糖溶液构象的影响 温度对裙带菜多糖溶液构象的影响见图5。由图5可知，不同温度处理的裙带菜粗多糖溶液紫外图谱近乎完全重合，这是由于温度没有使多糖物质的组成、含量和结构发生改变，多糖结构的价电子没有发生跃迁所以其紫外光谱图没有发生变化，因此，在20～100℃范围之内，温度对裙带菜多糖的构象无影响。

2.5.2.2 pH对裙带菜多糖构象的影响 pH对裙带菜多糖构象的影响见图6。由图6可知，不同pH下的裙带菜粗多糖溶液的紫外图谱略有差异，在碱性条件下紫外光谱的吸收强度变大，酸性条件下紫外光谱图吸收强度减小。一方面由于在酸性、中性介质中络合物不易形成，但随着pH的变大，络合物的阳离子解离，吸光度增大。另外裙带菜粗多糖溶液靠近中性范围氢键稳定，构象稳定。在较低或较高pH下，氢键受破坏，多糖构象发生变化。所以酸和碱都会引起裙带菜多糖溶液的构象变化，但这种变化较小。

图5 温度对裙带菜多糖紫外光谱的影响Fig.5 Effect of heat treatment on the UV spectrum of UPPS

图6 pH对裙带菜多糖紫外光谱的影响Fig.6 Effect of pH on the UV spectrum of UPPS

2.5.2.3 Ca2+对裙带菜多糖溶液构象的影响 Ca2+对裙带菜多糖溶液构象的影响见图7。由图7可知，加入CaCl2后裙带菜多糖溶液在190～400mn的紫外吸收强度都明显增加，紫外吸收略有红移，这说明Ca2+的加入，裙带菜多糖构象发生了较大的改变。推断原因可能是由于Ca2+与两链上的羧基作用引起两链间的聚合，Ca2+可与含羧基的酸性多糖作用，形成“蛋箱”结构，导致分子的不对称性增强[17]。

图7 Ca2+对裙带菜多糖紫外光谱的影响Fig.7 Effect of Ca2+on the UV spectrum of UPPS

2.5.2.4 络合物（硼酸）对裙带菜多糖溶液构象的影响 硼酸对裙带菜多糖溶液构象的影响如图8所示。由图8可知，硼酸处理过的裙带菜粗多糖溶液紫外光谱与空白组近乎完全重合，这可能是硼酸在水溶液中主要以未电离的B（OH）3形式存在，而B（OH）4-才是真正的络合剂。所以加入的硼酸与裙带菜粗多糖不能形成络合物，即络合剂硼酸对裙带菜多糖的构象不会造成影响。

图8 硼酸对裙带菜多糖紫外光谱的影响Fig.8 Effect of boric acid on the UV spectrum of UPPS

3 结论

本文采用超声波提取裙带菜多糖，其最佳提取工艺条件为：裙带菜粉与去离子水按1∶45的液料比混合，在80℃水浴中超声波浸提40min，多糖的提取率最高可达到7.56%。理化性质研究结果表明，该多糖易溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂，其水溶液成弱酸性；粗多糖中含有蛋白质，是一种含有硫酸基团的非还原性多糖。不同温度和硼酸处理裙带菜多糖，其构象几乎不发生变化；酸碱处理对裙带菜多糖的构象产生较小的影响；Ca2+对裙带菜多糖构象的影响极大。

[1]李兴霞，董淑风，刘禾蔚，等．烟台海域裙带菜营养成分分析及评价[J]．安徽农业科学，2010，38（33）：18768-18769.

[2]王敏．海洋蔬菜的四大养生功能[J]．中华养生保健，2006（10）：46-47.

[3]Maruyama H，Tamauchi H，Hashimoto M，et al.Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll of Undaria pinnatifida[J].In Vivo，2003，17（3）：245-249.

[4]邹向阳，王雪，王新华，等．裙带菜多糖诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的研究[J]．营养学报，2007，29（5）：470-472.

[5]Laurie ER，Sylvie LT，Martin B.Structural characterization of laminaran and galactofucan extracted from the brown seaweed Saccharina longicruris[J].Phytochemistry，2010，71（13）：1586-1595.

[6]Yang C，Chung DH，You SG.Determination of physicochemical properties of sulphated fucans from sporophyll of Undaria pinnatifida using light scattering technique[J].Food Chemistry，2008，111（2）：503-507.

[7]李建，杨波，季宇彬.超声波法提取裙带菜多糖的工艺研究[J].食品与药品，2010，12（11）：404-407.

[8]刘一鹿，方月妮，钱强.裙带菜多糖提取方法及其功用研究概述[J].大家健康，2013，7（2）：12.

[9]朱良，张青，朱钦昌，等．正交设计优化裙带菜孢子多糖提取工艺[J]．中国海洋药物杂志，2006，25（6）：42-45.

[10]刘莹，赵杰．褐蘑菇多糖的理化性质初步研究[J]．湖北农业科学，2012，51（5）：981-982.

[11]强亦忠，王崇道，邵源，等．海藻硫酸多糖的制备及其性质研究[J]．苏州大学学报：医学版，2003，23（4）：391-393.

[12]孙玉军，陈彦，王瑞君，等．车前草多糖的结构和性质初探[J]．热带作物学报，2012，33（10）：1882-1885.

[13]朱彩萍．枸杞多糖的结构分析及生物活性评价[D]．武汉：华中农业大学，2006.

[14]刘利萍，钟引飞．海带多糖的超声波提取及对自由基清除作用研究[J]．绍兴文理学院学报，2005，25（7）：49-51.

[15]廖建民，张瑾，沈子龙．超声波法提取海带多糖的研究[J]．药物生物技术，2002，9（3）：157-160.

[16]覃海元，潘嫣丽，覃梅珍．热水与超声波提取鹿角灵芝多糖工艺比较研究[J]．中国食品添加剂，2011（3）：91-95.

[17]王艳丽，张静．白术多糖的溶液构象及其变化[J]．陕西师范大学学报：自然科学版，2012，40（3）：98-103.

Study on the ultrasonic-assisted extraction of polysaccharide from Undaria pinnatifida and its characterization

CHENG Ling-yun，HUANG Guo-qing，XIAO Jun-xia*
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

In this paper，Undaria pinnatifida polysaccharides（UPPS）were extracted by ultrasonic-assisted method.The content of polysaccharides was measured by phenol-sulfate method.Effects of three factors on the extraction，including extraction temperature，extraction time and solid/solvent ratio were studied by single factor and the optimum extraction conditions were then determined through the orthogonal experiment. Meanwhile，physical and chemical properties of the resultant polysaccharide were also concerned in this paper. Results showed that these optimum extraction conditions as follows：solid/liquid ratio 1∶45（g/mL），extraction temperature 80℃，and extracting duration 40min.Under such conditions，the yield of the polysaccharide reached 7.56%.Physicochemical analysis revealed that the polysaccharide contained protein and sulfate radicals，but no starch was detected in it.The structure of the Undaria pinnatifida polysaccharides remained intact after exposure to high temperature or H3BO4.However，the polysaccharide was slightly affected by acid or alkali and the conformation of the polysaccharide was significantly damaged by Ca2+.

Undaria pinnatifida；polysaccharides；ultrasonic-assisted extraction

TS255.1

B

1002-0306（2014）06-0260-05

2013－07－22 *通讯联系人

程玲云（1988-），女，在读硕士研究生，主要从事功能因子稳态化技术方面的研究。