临床分子病理检查的发展与展望

□张品南ZHANG Pin-nan 冯国飞FENG Guo-fei 陈艳梅CHEN Yan-mei 黄益HUANG Yi

一直以来基于组织形态学特征的病理学诊断是肿瘤诊断的“金标准”和临床治疗的基础[1]，但越来越多的证据表明：患同一组织学类型，同一TNM分期的肿瘤如采用相同的治疗方案，患者治疗的反应和预后并不一致。事实上，肿瘤，特别是恶性肿瘤是一类分子水平上高度异质性疾病[2]，传统病理形态学诊断已不能适应现代肿瘤诊治的需要。随着现代生物技术飞速发展，肿瘤的病理诊断已从表型（phenotype）分析发展到表型和基因型（genotype）结合分析代表着当代医学的革命性进步。临床分子病理学，或称分子诊断，已成为当今迅猛兴起的病理亚学科之一。它从核酸水平（DNA和RNA）研究疾病发生发展规律来揭示疾病外源性基因在体内的存在和内源性基因突变及表达异常，是传统形态病理学的有益补充和发展。即病理学已从传统的病理形态学诊断迈向整合病理学（integrated pathology）时代[3]，这极大地丰富了病理诊断的内涵，使之从单纯的病理形态学诊断扩展到对疾病的易感性和发病的风险性评估、疾病的预防、预后判断、个性化治疗（如靶向治疗）方案的制定等诊断与指导性内容。整合性病理诊断会涉及到一些遗传性肿瘤的筛查与预防，如遗传性胃印戒细胞癌可通过鉴定E—cadherin (CDHE) 基因的生发性突变，进而筛查其相关亲属，对突变基因携带者进行全胃预防性切除以有效预防此类胃癌的发生。整合性病理诊断的开展将使病理诊断医师融入患者的多学科治疗团队，指导治疗，真正使病理医师成为医师中的医师。如乳腺癌的诊断，现在一个合格而规范的诊断报告应包括组织学类型和分级，雌激素受体（ER），孕激素受体（PR）Ki-67以及HER2蛋白免疫组织化学结果HER2基因荧光原位杂交（FISH）检测结果和致癌基因（BRCA1/2）。其中HER2基因检测要准确、可靠和可重复性高的标准化检测结果，其报告包括：（1）肿瘤存在异质性扩增所占比例；（2）两群细胞的HER2、CEP17拷贝数及比值；（3）异质性扩增细胞是弥漫分布还是成簇分布；（4）是否有组织学改变。只有病理报告完整、全面、规范，临床医师才能实施规范而有效的个体化治疗。又如肺腺癌的正确病理诊断对正确治疗尤为重要，非小细胞肺癌在做治疗前应检测K-ras、表皮生长因子受体（EGFR）基因突变情况和EML4-ALK基因情况。EGFR基因突变提示该肿瘤对酪氨酸抑制剂（TKI）有治疗反应，如果有K-RAS突变的患者对TKI会产生原发耐药。一般非小细胞肺癌患者EML4-ALK阳性率很低，约为3%-7%左右。女性“亚裔”无或少量吸烟史的肺腺癌组患者能在EMFR-TKI中获益，因而对此类病人的治疗策略要改变[4]。分子病理诊断已从起步阶段进入快速发展阶段。随着核酸序列分析方法的不断进步，全基因组扫描不久将成为现实，与医学生物信息学相结合的整合病理学诊断也将更上一层楼。

目前，国内分子检查虽总体发展势头良好，但也存在一些问题。如规范化、标准化问题，如果不引起足够重视，不仅会影响病理业界自身声誉及其进一步发展，甚至给临床诊断和靶向治疗造成不良影响。针对目前我国分子病理诊断中存在的诸多问题，特提出建议如下。

尽快扭转病理学科发展困境局面

目前，病理科面临四大发展困境：其一人才流失严重。由于病理医生职业风险大、任务重、待遇低[5]，大学本科毕业或研究生很少有人选择临床病理专业，甚至病理专业的研究生毕业后也不愿做病理而选择其他临床科室，有的已从事临床病理工作多年并打下一定病理基础的病理从业人员也千方百计离开病理科而转至临床科室或通过工作单位调动方式离开病理科，造成病理专业人才严重流失。有些基层医院病理科甚至出现病理医师后继无人、队伍断层的现象。其二病理科被划入医技辅助科室颇具中国特色，因为在发达国家，病理科是标准的临床科室。正因为是辅助科室，病理科也就享有了很多“辅助”待遇，不仅收入（奖金）提成比例低，有的病理科还要给临床开检查单医师“好处费（回扣）”，这是很不合理的事情。其三病理检查至少忙碌了三个工作日只收费60元（小标本）与临床某些血液项目检查在机器上过一过就几百元甚至上千元形成强烈反差，这也与病理医师的脑力和体力的高额投入形成了极大反差，也让国外同仁费解。由于收费低，院领导不重视，制约了病理学科的发展。其四病理学科设置缺陷。我国的学科划分将病理学和病理生理学一并划分为基础医学二级学科，没有设临床病理学的三级学科，因此病理学培养研究生都归为基础医学（科研型），无法招收和培养临床型的病理研究生，甚至出现科研型病理专业毕业的研究生没有资格参加执业医师资格考试的怪现象，使得病理专业的硕、博研究生毕业后转行分流，在本来病理研究生生源短缺的情况下造成进一步的病理专业人才流失。由于人才缺乏，我国病理诊断水平参差不齐，特别在中、小医院，对于一些疑难病例存在较高的误诊率在所难免，导致患者或其家属带着病理切片到全国各地会诊，造成不必要的经济和医疗资源浪费及“医闹”事件的发生。

尽管病理科陷入发展困境的原因很多，既有国家宏观政策上的失误，也有医院认识上的误区。由于不合理的制度、市场导向、人才培养机制等多种原因综合在一起，导致病理学科萎缩，人才流失严重，发展后劲乏力，问题的严重性已经到了必须要拯救的地步。为此，我们呼吁：从国家层面上要制定相应政策措施，亟待纠正政策偏差，制定更加合理的倾斜政策，从根本上改善病理科的地位。目前，国内医疗行业存在的“大检验，小病理”现象显然不利于医学的发展，更不利于医疗质量的提高。在临床实验室的认可逐渐呈现国际化趋势及实验室认可已在全球得到广泛接受的现状下，ISO15189应运而生[6]。ISO15189由ISO18025衍生而来，两者均适用于医学实验室，除包括对检验人员的能力认证外，更注重“方法、机器、试剂”的认证管理；而病理学科诊断报告是更需要病理医师个人能力的独立性诊断报告，有别于检验科的更多依赖于设备、试剂和方法的检测报告。因此，CNAL-CL33（医学实验室质量和能力认可准则在病理学领域的应用说明）认证病理科的技术室较为合适，而对病理医师的认证参照ISO17020制定的病理医师能力认证标准更为科学。欧美国家的病理科与我国的病理科的设置与概念是完全不同的，欧美国家的病理科包括解剖病理（相当于我国内地的病理科）和临床病理（相当于我国内地的检验科），无独立的检验科。检验科是在病理科领导与管理下开展工作的。我国由于科室设置的不科学，病理科与检验科在诸如细胞学、PCR的应用（PCR集中设置在检验科）等相关工作内容有交叉的领域难以“和谐”。分子医学时代的到来，在临床医师热衷的分子靶点治疗的形势下，病理医师如何与检验科或其他实验室协调应用PCR开展分子靶点检测显得左右为难。鉴于此，弱小的病理科与强大的检验科合并成立欧美模式下的“大病理”科室或者病理检验中心（行政主任由病理科担任、行政副主任由检验科担任）是更科学的学科设置。这有利于医学事业的发展，也有利于医疗机构的科学管理，更有利于学科人才的稳定与培养。从医院层面上要纠正认识上的误区，明确病理科为非盈利科室，解除其盈利枷锁。在收费提成、成本核算、人员配置、奖金分配等方面给予政策上的倾斜，并重点扶持，特别是奖金分配上应与临床医师同等待遇，因为病理医师是医师中的医师，怎么能低人一等呢？从病理科自身层面上要处理好教学、科研与医疗三者的关系是病理科快速发展的一个棘手课题。欧美发达国家都有自己独特的发展模式，德国的模式应该是我们可以试点改革的模式，德国病理科医师人均诊断的病例数与我国大多数病理医师相近或稍多，但他们有强大的技术员队伍和秘书系统。这个系统在保证技术质量的前提下将技术含量低的工作有序转移，以保证医师集中精力作诊断。

分子病理检查的规范化问题及建议

目前，我国病理科分子病理检查发展不平衡，大多数分子病理检查项目是由高校和商业公司运行操作。使得大部分基层医院病理科医师不知道分子病理检查的技术操作和检查结果的意义。因此加强我国病理医师的分子病理技术培训是目前健康稳定地发展我国分子病理事业的重要环节。由于种种原因，国内各家医院在FISH、基因突变检查、mRNA和其他一些项目检测的实验方法、试剂和设备等方面无统一规范标准，导致进行同样的检查项目，不同医院得出不同结果，既让人感到困惑，又引发医疗纠纷。因此，分子病理检测方法必须规范和统一。现阶段我国分子病理检查主要包括FISH、基因突变检查、mRNA等项目。其中FISH是最广泛应用的基因扩增检测技术。其诊断试剂主要是中国金菩嘉公司或者美国Vysis公司产品。美国Vysis公司产品虽然通过美国食品药品管理局认证，但在中国尚未取得认证。为保证检查质量，必须统一使用有认证的产品。影响FISH检查结果的重要因素除试剂外，组织标本的固定也非常重要。进行FISH检查的组织标本要求采用10%甲醛液固定，其量要达到组织的10倍。手术大标本固定时间为12-48小时，活检标本不超过24小时。规范的标本固定是保证FISH检查质量的重要步骤，基因突变检测方法较多，包括直接测序法、TaqMan探针PCR法、ARMS法等。每种方法都有其优缺点。直接测序法是经典的突变检测方法，价格低，结果也较可靠，但其检测敏感性较TaqMan探针法和ARMS法低。多种突变检测方法的存在给质量控制带来困难。检测的敏感性不同，也可能引起医疗纠纷。mRNA检查也因检查标本的多样性（穿刺标本、新鲜组织标本和石蜡标本）和取材时间的差异性可能会在mRNA水平上出现非常大的差异性。虽然可以通过看家基因设立内参照，但目前尚无一种理想的方法来校正这种差异。而且国内实验室判断mRNA的标准通常采用国外杂志上论文的数据，尚无真正意义上的国家标准。为保证分子病理检测质量，国内病理界应尽快联合起来，研究制定适合我国国民不同组织的各种mRNA判断标准。同时组建国家级、省级、市级三级网络的分子病理检测重点实验室，分别由国家、省、市财政扶植，并制定完善的统一规范和质量控制标准来保证分子病理检测质量。由于国内各单位给出的分子病理检查报告形式多样，各不相同，有的报告只给出检查中采集的图片，有的只给予结果。对此，也应制定全国统一的分子病理检查报告标准。其内容除规范的分子病理检查报告内容外，还应包括使用的试剂、方法、阴性和阳性判断标准，3-5幅图片以及结果的说明和临床意义等相关内容。同时，制定统一的收费标准，并纳入医保范围。

加强基因型分析与分子病理诊断

感染因子的基因型分析具有敏感、快速、特异和定位准确的特点。利用real-time PCR技术检测病原微生物特异性基因片段，灵敏度可达到每次反应几个拷贝，操作简单易行，对生长周期长，培养条件苛刻的细菌及真菌极具优势。对白血病长期化疗合并严重鹅口疮的患者，基因型检测不仅能快速确诊念珠菌感染，还可以对传统培养法无法鉴别的白色念珠菌和近年发现的都柏林念珠菌等特异性菌种进一步分型，有助于及时选择敏感药物，挽救病人生命。对宫颈活检标本采用原位杂交技术可显示HPV 16/18型病毒E6、E7片段在细胞核内的定位和基因组整合状态，有助于确定合理的癌前病变处理方案和随访原则。对结直肠肠病型T细胞淋巴瘤中EB病毒编码小RNA（EBER）的检测，可以明确可疑细胞的病毒感染状态，有助于淋巴瘤的鉴别诊断。对于形态学诊断困难或不常见部位发生的滑膜肉瘤，检测SYT-SSX融合基因很有意义，因为该种基因融合仅见于滑膜肉瘤。根据基因型分析和免疫组织化学结果可将浸润性乳腺癌精确细分为激素受体阳性乳腺癌（ER、PR阳性表达），HER2阳性乳腺癌（HER2阳性、ER、PR阴性），三阴性乳腺癌（ER、PR、HER2均阴性）和三阳性乳腺癌（ER、PR、HER2均阳性），其生物学特性、临床表现、治疗方案选择和预后截然不同，可见肿瘤基因分析在病理学诊断基础上增加了预测和预后因素的解释。胃肠道间质瘤（GIST）成为一个独立疾病单位，是基因型分析与病理诊断相结合的里程碑。C-kit和PDGFRA基因突变及ckit(CD117)表达作为GIST明确的诊断指标和酪氨酸激酶抑制剂格列卫靶向治疗的预测因子已成为共识。现今从基因型分析角度可将结直肠癌分为染色体不稳定性结直肠癌（占85%）和微卫星不稳定性结直肠癌（占15%）[7]。后者多见于右半结肠，癌细胞由分化稍差的二倍体细胞组成，产粘液，少转移，预后稍好。在肿瘤发生早期检测K-ras基因状态有助于了解病情，结直肠癌、胰腺癌等肿瘤早期，患者症状不明显，K-ras基因突变可作为高危因素，实现癌症的早发现、早治疗，以免错过最佳治疗时机。但其更重要的角色是预测针对EGFR突变的靶向药物的疗效[8]。

迅速发展的分子病理学诊断已经成为人们关注的热点，靶向治疗的基础是靶向诊断，靶向诊断由病理医师来完成。个体化医学对病理学科来说既是挑战，又是病理学发展的机遇，机会稍纵即逝，错失良机将会给后代留下无法弥补的遗憾。

病理医生在病理组织学诊断基础上，通过基因型分析识别出疾病特有的基因异常（DNA）和生物标志物（mRNA），认识疾病的发生、发展规律。尤其恶性肿瘤还可预测其易感性、转移潜能、靶向治疗敏感性和耐药性，并促进了许多新的分子诊断检测项目的诞生，又能为临床医师和患者提供更多的治疗相关信息。真正起到了医师中的医师作用。我们已然意识到分子病理学的发展趋势，将以极大的热忱投入到“分子时代”的激流之中，为之奋斗与倾力。因为分子病理是疾病诊断“金标准”中的“金标准”，它不仅能做出精确的疾病诊断，协助临床医师进行疾病预测、靶向治疗和预后分析，还将为患者提供其一生的个体化疾病预防性建议。此外，病理科存储的大量组织标本档案资料和基因学信息还可为基础医学提供可观的研究素材，为转化医学服务，如第三代测序中的单分子即时DNA测序和纳米技术能直接读取RNA序列或甲基化修饰的核酸序列而无需特异的PCR反应，使表观遗传学和后基因组研究如虎添翼。可以预测基因型分析对于病理工作者已不再是锦上添花的基础性研究，而是病理诊断不可或缺的实践技术。所以加强分子病理检查与诊断，提高病理诊断含金量至关重要。

总之，强调病理诊断是“金标准”，病理医师是医师中的医师，反映了正确的病理诊断的重要性，医疗行政部门和医院的各级领导应注重病理科的建设，同时也意味着病理工作的责任重大，只有各方共同努力才能不断提高病理诊断“金标准”的含金量。

分子病理检查是病理诊断的重要部分，代表了当代病理发展乃至医学发展的趋势。我国病理科如何根据个体化治疗的需要，调整病理科的整体布局，是一个战略性问题，我们强烈呼吁国家有关管理部门尽快制定分子病理学诊断与技术规范化与标准化专家共识意见和分子病理检查的价格标准和医保政策。

1 胥雪冬，董书.加强医院病理科管理与质量控制的5点建议——1例临床标本混淆引起的思考[J].中国医院管理，2011,31(12):25-26

2 张品南，冯国飞，陈艳梅.肿瘤分子分型与靶向治疗[J].医学研究杂志，2009,38(6):9-11

3 来茂德.中国病理学发展的现状和未来[J].中华病理学杂志，2012,41(1):1-3

4 陈晓霞，周彩存.分子病理检测在非小细胞肺癌诊疗中的意义[J].中华病理学杂志，2012,41(8):570-572

5 张品南，冯国飞.临床病理风险的防范与对策[J].医院管理论坛，2012,29(8):15-19

6 孟刚.中国大陆病理行业发展存在的体制性问题及对策探讨[J].临床与实验病理学杂志，2012,28(1)5-7

7 VilarE，Gruber SB.Microsatellite instability in colorectal cancer the stable evidence[J].Nat Rev Clin Oncol，2010,7(3):153-162

8 李占稳，刘玉琴.K-ras基因突变相关的肿瘤靶向治疗进展[J].中华病理学杂志，2012,41(1):59-61