植物雌激素类药物治疗骨肉瘤的基础研究进展

宋明智，张 振，王寿宇(综述)，吕德成(审校)

(大连医科大学附属第一医院骨科，辽宁 大连116021)

骨肉瘤来源于原始的成骨间充质干细胞，是成人及儿童骨组织中最常见的非血源性恶性肿瘤[1]。病灶常见于长骨干骺端毗邻或包绕生长板处，其中约75%位于股骨远端及胫骨近端[2-3]。该病具有发病率高、对化疗抵抗[1]、预后差[3]、易向肺部转移[4]等特点，现已成为临床治疗中的疑难疾病。目前，治疗骨肉瘤的标准方法为广泛切除原发恶变组织联合细胞毒性化疗药物，但由于多种化疗药物具有全身毒性[5]，故使用传统化疗药物很难达到满意的疗效。因此，人们不断努力希望找到安全有效的抗骨肉瘤药物。雌激素在调节青春期骨生长以及成年人骨重构的过程中发挥重要作用[6]，但肿瘤患者过量使用该化合物所产生的不良反应极多，甚至促进肿瘤生长[7]。而大量研究证实植物中含有类雌激素物质，因其具有明确的抗癌活性，且不良反应较小，故为开发新型抗骨肉瘤药物提供了新的选择。该文就植物雌激素治疗骨肉瘤的研究成果进行综述。

1 植物雌激素的来源与分类

植物性雌激素广泛存在于植物中，是一种能够结合哺乳类动物雌激素受体，并产生激动、抑制、部分激动/抑制效应[8]的非甾族化合物。植物雌激素按其分子结构可分为5类[9-11]。①异黄酮类：该类天然化合物广泛存在于多种植物中，在大豆中含量尤为丰富。主要有金雀异黄素、大豆苷元、大豆黄素、芒柄花素、葛根素等。②黄酮：主要包括芹黄素、山奈黄素、槲皮素等，在芫花及银杏中含量较多。③木脂素类：木脂素类存在于植物的木部和树脂中，主要有芝麻素和厚朴酚两种。④香豆素类：是从植物的花、茎、叶及果实中所提取的化合物，其典型代表是拟雌内酯。⑤芪类：广泛分布于种子植物中，白芦藜醇是研究最早也是研究最多的芪类化合物。⑥其他：α-玉米赤霉烯酮等。

2 植物雌激素治疗骨肉瘤的作用机制

目前普遍认为,植物雌激素发挥抗骨肉瘤活性的结构基础是与骨肉瘤细胞中的雌激素受体结合，影响多种信号转导途径及细胞代谢，进而引起细胞增殖、凋亡、分化、侵袭及迁移能力的改变[12]。

2.1对骨肉瘤细胞增殖的影响 植物雌激素抑制骨肉瘤细胞增殖已成为研究的重点。Nikitovic等[13]首次将金雀异黄素用于骨肉瘤的基础研究中，试验选用SAOS-2及MG-63两种人骨肉瘤细胞系，对药物作用后细胞外基质中特定代谢产物的浓度进行检测，结果发现金雀异黄素能够影响不同骨肉瘤细胞中葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAG)与蛋白聚糖(proteoglycans，PG)水平的比值变化，而GAG/PG是影响骨肉瘤增殖的关键因素[14]，Nikitovic等[13]认为金雀异黄素引起SAOS-2细胞GAG/PG变化的机制很可能与蛋白酪氨酸激酶系统的活化有关，而抑制MG-63细胞合成PG的机制尚不清楚。

促分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路是近年来肿瘤研究最活跃的领域，大量研究显示，肿瘤细胞的增殖变化与MAPK信号转导密切相关。Chrzan等[15]发现,大豆苷元能有效阻止人骨肉瘤细胞系G-292产生白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，而IL-1β已被证实可通过MAPK级联信号转导通路刺激骨肉瘤细胞增殖[16]。Alkhalaf等[17]采用人骨肉瘤细胞系SJSA1细胞对白芦藜醇所引起的MAPK/p53通路变化进行研究，结果发现该化合物可诱导产生剂量依赖性生长抑制作用并降低细胞活力，这些效果在应用MAPK抑制剂PD98059后消失，由此作者推测白芦藜醇所引起的生长抑制作用是通过调控MAPK(细胞外信号调节激酶1/2)通路及激活肿瘤抑制蛋白p53功能而实现的，该研究还发现该化合物对骨肉瘤的生长抑制作用优于T47D、MCF7、MDA-MB-231等乳腺癌细胞系。

此外，细胞周期调控异常与肿瘤发生、发展关系密切，细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶结合并激活后者诱导蛋白磷酸化，促使细胞由G1期进入S期。Yokota等[18]通过试验证实，芝麻素能够通过蛋白酶体途径下调包括骨肉瘤MG-63细胞中周期蛋白 D1的表达，这很有可能是其抗增殖作用的机制之一。还有报道称白芦藜醇参与了U-2OS细胞的DNA修复和细胞周期调控，试验结果显示白芦藜醇上调了U-2OS细胞中乳腺癌易患基因1及端粒蛋白的表达，诱导端粒稳定性发生变化，同时激活DNA损伤信号，进而发挥抑增殖作用[19]。

2.2对骨肉瘤细胞凋亡的影响 植物雌激素可通过多种不同途径诱导骨肉瘤细胞凋亡。金雀异黄素及大豆黄素处理转染雌激素受体的U-2OS细胞时，可将细胞周期阻滞于S期，并通过启动凋亡程序显著降低细胞生存率，这可能与植物雌激素诱导表皮生长因子受体下调有关[6]。Huang等[20]的最新研究显示，山奈黄素具有低细胞毒性，对多种骨肉瘤细胞系具有明显的促凋亡作用，尤其是对U-2OS细胞的疗效具有剂量依赖性。该研究还发现，经治疗后细胞核中DNA断裂、胞质Ca2+水平增高、线粒体膜电位下降、时间依赖性蛋白质的表达受到影响。Huang等[20]认为，山奈黄素的抗骨肉瘤活性很可能与内质网应激通路及线粒体信号转导通路有关。Lin等[21]证实了芹黄素对骨肉瘤的疗效，并提出芹黄素引起细胞凋亡的外源性信号转导通路，他们发现芹黄素可激活胱天蛋白酶-3、-8、-9及Bax并释放凋亡诱导因子，引发线粒体功能障碍，从而降低U-2OS细胞的存活率。Liu等[22]对不同浓度治疗组中的生存素及p21cip1/WAFI蛋白表达及相应mRNA进行检测，结果显示白芦藜醇很可能通过调节生存素及p21cip1/WAFI的表达变化，从而发挥对MG-63细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。

2.3对骨肉瘤细胞分化的影响 随着研究的不断深入，也有学者将植物雌激素促骨肉瘤细胞分化作为研究的切入点[23]。有报道称，金雀异黄素能够诱导小鼠骨肉瘤细胞系LM8发生分化[23]。研究人员对各组细胞进行苏木精-伊红染色及反转录-聚合酶链反应检测，发现经金雀异黄素处理后的LM8细胞形态发生明显变化，同时，治疗组骨钙蛋白mRNA表达水平显著增高[23]。金雀异黄素还可促使细胞合成大量的胶原蛋白、碱性磷酸酶及形成矿化小结，以诱导MG-63细胞的分化[9]。Salvatori等[6]认为金雀异黄素及大豆黄素作用转染雌激素受体的U-2OS细胞后，通过激发表皮生长因子受体信号转导途径，上调骨唾液蛋白及骨钙蛋白的表达，促使其向成骨细胞分化。

2.4对骨肉瘤细胞的侵袭及迁移能力的影响 侵袭及转移能力常作为衡量骨肉瘤恶性程度的重要标准，同样引起了研究人员的关注。植物雌激素很有可能通过改变特定蛋白表达水平以影响骨肉瘤细胞侵袭及迁移能力。Nakamura等[23]发现，经金雀异黄素治疗的鼠骨肉瘤LM8细胞表达及分泌的基质金属蛋白酶2少于对照组，钙紧张素的分布情况也有明显变化，对照组细胞中钙紧张素出现在胞质及细胞核处，而治疗组细胞的钙紧张素表达量更高并易位至近质膜处。经大豆苷元处理的骨肉瘤G-292细胞能有效阻止细胞因子IL-6的分泌[15]，当前研究认为IL-6能够激活信号转导与转录激活因子3通路促进骨肉瘤细胞的迁移[24]。拟雌内酯亦能够抑制骨肉瘤细胞IL-6促进子的活性，并具有剂量依赖性。Steinmann等[25]的研究证实厚朴酚能有效阻止骨肉瘤细胞迁移，该试验结果显示，小鼠骨肉瘤细胞系LM8-lacZ在厚朴酚浓度达5000～10000 μg/L时，迁移强度随药物浓度变化呈剂量依赖性，当药物浓度达15000 μg/L时，该细胞迁移的活动基本终止。

2.5其他 为解决长期使用传统化疗药物所导致的药物抵抗及减少药物剂量问题，研究人员将安全有效的植物雌激素与化疗药物联用，获得了较好的效果。Zhang等[26]将金雀异黄素与常规化疗药物吉西他滨联合应用对MG-63及U-2OS两种骨肉瘤细胞系进行体外试验，结果显示金雀异黄素能够增强吉西他滨诱导的骨肉瘤细胞凋亡过程，研究发现吉西他滨仅能够通过激活核因子κB通路发挥抗癌活性，故易引起药物抵抗。而金雀异黄素具有抑制核因子κB通路及阻滞蛋白激酶B信号转导通路的生物活性[27]，可以扭转吉西他滨造成的由头段开始的药物抵抗。Liang等[28]的最新研究显示，对MNNG/HOS骨肉瘤细胞系进行的体内、外试验得到了相同的结论，金雀异黄素能够通过抑制蛋白激酶B/激活核因子κB信号转导通路，以增强吉西他滨的诱导凋亡作用，更加验证了金雀异黄素与吉西他滨联合应用有望成为一种既合理又有效的化疗方法。

亦有研究对植物雌激素类衍生物的抗骨肉瘤能力进行了探索。人工合成的3′,4′-二氯-3-(3,4-二氯苯乙酰)-2,4,6-三羟基脱氧安息香是异黄酮类衍生物，可以诱导多种骨肉瘤细胞凋亡，其作用机制与激活活性氧-凋亡信号调节激酶1-丝裂原活化的蛋白激酶激酶-3/6-p38信号通路有关[29]。另一种新型异黄酮衍生物7-羟基-3′,4′-苯并异黄酮亦可引起活性氧-凋亡信号调节激酶1-丝裂原活化的蛋白激酶激酶-3/6-p38信号级联反应放大，促进骨肉瘤细胞系U-2OS中p53活化及Bax表达，从而发挥抗骨肉瘤作用[30]。

3 展 望

植物雌激素类药物在治疗骨肉瘤方面的优势已崭露头角，并引起了该领域研究者的广泛关注。虽然目前对于植物雌激素治疗骨肉瘤的研究多以体外试验为主，且研究的重心主要在于探讨不同植物雌激素发挥抗骨肉瘤作用的可能机制，但不可否认该领域极具科研潜力，还有很多问题亟需研究解决，如多种植物粗提取物已被证实具有抗骨肉瘤活性，成分中是否存在未知的植物雌激素；除雌激素受体外，骨肉瘤细胞中是否存在其他能够与植物雌激素结合的受体；部分植物雌激素抗癌具有双向调节作用，如何确定浓度临界点有待探讨；能否对该类化合物结构进行改造，使其更有利于发挥抗骨肉瘤作用；多种植物雌激素联合治疗骨肉瘤效果如何。此外，与常规化疗药物相比，该类化合物的抗骨肉瘤效果稍弱，但其来源广泛、安全、无毒、无不良反应、可与化疗药物联用、不易产生耐药，更符合现代医学发展规律，具有极强的临床推广及应用价值。

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