正交试验法优选痛风颗粒醇提工艺

陈梓贤，李建利，2，罗悦，王利洁

·炮制制剂·

正交试验法优选痛风颗粒醇提工艺

陈梓贤1，李建利1，2，罗悦1，王利洁1

目的：优选痛风颗粒的醇提取工艺。方法：采用L9（34）正交试验优选提取工艺条件，以苍术素，盐酸小檗碱和干膏收率的综合评分为指标，考察乙醇用量，乙醇浓度、提取次数和提取时间对醇提工艺条件的影响。结果：最佳提取工艺为加6倍量60%的乙醇，提取3次，每次0.5小时。结论：优选所得提取工艺条件稳定可行，适用于痛风颗粒的工业化生产。

痛风颗粒；醇提工艺；正交设计

苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.) DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎，具有燥湿健脾，祛风散寒、明目的功效，其化学成分有苍术素、苍术酮等，且含量相对较高[1]。关黄柏为芸香科植物黄檗Phellodndron amurense Rupr.的干燥树皮，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮的作用，其主要含小檗碱类生物碱[2]。川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula offcinalis Kuan.的干燥根，具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋的功能，植物甾酮类成分为川牛膝中的主要有效组分[3]。

痛风颗粒为四川省中医药科学院中医研究所承担研发的第六类新药，由金银花、板蓝根、苍术、川牛膝、关黄柏等13味中药组成，具有清热解毒，祛风止痛，燥湿健脾之功效，主要用于痛风痹痛证的治疗。复方中苍术，关黄柏和川牛膝均含有较多的脂溶性成分，与其清热祛风，燥湿健脾的功能关系密切。本试验根据药物的性质，采用正交试验设计优选提取工艺，采用高效液相色谱法测定提取工艺中指标性成分苍术素和盐酸小檗碱的含量，以苍术素含量、盐酸小檗碱含量及干膏收率为考察对象进行综合评分，确定痛风颗粒最佳提取工艺条件，从而为痛风颗粒的成型工艺研究提供试验依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（仪器包括：Agilent色谱工作站、VMD紫外检查器，美国安捷伦公司）；DJ600-2型电子天平（成都倍塞克仪器表研究所）；电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）；GHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.2 材料

关黄柏饮片、川牛膝饮片、苍术饮片均购于四川省中药饮片有限责任公司，并经成都中医药大学中药鉴定教研室卢先明教授鉴定，苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎，关黄柏为芸香科植物黄檗Phellodndron amurense Rupr.的干燥树皮，川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula offcinalis Kuan.的干燥根，均符合《中国药典》2010年版一部及《四川省中药饮片炮制规范》2002年版相关项下规定。苍术素对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：111924-201102，供含量测定用）；盐酸小檗碱对照品（购于中国药品生物制品检定所，批号：110713-200911，供含量测定用）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

根据预实验结果，对影响该工艺的主要因素：加醇量，加醇浓度，提取次数，提取时间，用L9（34）正交试验表进行优选。以盐酸小檗碱、苍术素、干膏收率为考察指标；各指标的权重评分为，干膏收率占20分，盐酸小檗碱占40分，苍术素占40分，总分为100分。因素与水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

2.2 干膏收率的测定

精密吸取按正交试验表试验得到的各份药材醇提液20mL于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后移至干燥箱105℃干燥3h，取出，移至干燥器中，冷却30分钟，迅速称重，计算干膏收率。

2.3 苍术素含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250mm），5μm；流动相：甲醇-水（80:20）；流速：1mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：340 nm；理论塔板数按苍术素峰计算不低于5000。见图1。

图1 阴性对照（A）、苍术素对照品（B）、供试品（C）的HPLC色谱图

2.3.2 对照品与供试品溶液的制备 取苍术素对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加甲醇制成0.02136 mg．mL-1的溶液，即得对照品溶液。

称取痛风颗粒处方各味药材，共22g，平行9份，依次按照正交试验表中确定的试验条件操作，将所得药液滤过，滤液定容至250mL瓶中，将滤液用微孔滤膜滤过即得供试品溶液。

2.3.3 阴性对照溶液的制备 处方比例，取除苍术以外的其他味药，按“2.3.2”供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3.4 线性考察 分别精密吸取上述苍术素对照品溶液，分别进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL，测定其峰面积。以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=11584.996X－7.581，r=0.9999。结果表明苍术素进样量在0.0427～0.4272mg•mL-1范围内，与峰面积线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 精密称取上述苍术素对照品溶液10μL，连续进样6次，依法测定，结果苍术素峰面积的RSD值为0.98%，表明该仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取上述苍术素对照品溶液和“2.3.2”项下正交试验 2号样品贮备液制成的供试品溶液，分别在0h、6h、12h、16h、24h、48h进样10μL，测定苍术素的峰面积。结果对照品溶液苍术素峰面积RSD值为0.75%（n=6），供试品溶液中苍术素峰面积RSD值为0.83%（n=6），表明对照品溶液和供试品溶液在48h内基本稳定。

2.3.7 重复性试验 取“2.3.2”项下2号样品贮备液，按供试品溶液的制备方法，制备5份供试品溶液，分别进样10μL，依法测定，结果苍术素峰面积RSD值为0.63%，表明该方法重现性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品溶液1mL（0.1737mg．mL-1），共6份，按《中国药典》2010年版一部附录XVIIIA项下方法，计算加入等量苍术素对照品溶液，按上述色谱条件下测定，计算苍术素的加样回收率。结果平均回收率99.84%，RSD值为1.72%（n=6），表明本品回收率符合要求。

2.3.9 样品测定 取供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.4 盐酸小檗碱含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250mm），5μm；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～20min，73%A；20～25min，40%A；25～35min，10%A；35～40min，90%A；40～45min，73%A）；流速：1mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：345 nm；理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于4000。见图2。

图2 阴性对照（A）、盐酸小檗碱对照品（B）、供试品（C）的HPLC色谱图

2.4.2 对照品与供试品溶液的制备 盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加60%乙醇制成0.0576 mg．mL-1的溶液，即得对照品溶液。

称取痛风颗粒处方各味药材，共22g，平行9份，依次按照正交试验表中确定的试验条件操作，将所得药液滤过，滤液定容至250ml瓶中，将滤液用微孔滤膜滤过即得供试品溶液。

2.4.3 阴性对照溶液的制备 按处方比例，取除关黄柏以外的其他味药，按“2.4.2”供试品制备方法制备阴性对照溶液。

2.4.4 线性考察 分别精密吸取上述盐酸小檗碱对照品溶液，分别进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL，测定其峰面积。以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=3870.462X－14.693，r=0.9998。结果表明盐酸小檗碱的进样量在0.0115～0.1152mg．mL-1范围内，与峰面积线性关系良好。

2.4.5 精密度试验 精密称取上述盐酸小檗碱对照品溶液10μL，连续进样6次，依法测定，结果盐酸小檗碱峰面积的RSD值为0.93%，表明该仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取上述盐酸小檗碱对照品溶液和“2.4.2”项下正交试验2号样品贮备液制成的供试品溶液，分别在0h、6h、12h、16h、24h、48h进样10μL，测定盐酸小檗碱的峰面积。结果对照品溶液盐酸小檗碱峰面积RSD值为0.62%（n=6），供试品溶液中盐酸小檗碱峰面积RSD值为0.71%（n=6），表明对照品溶液和供试品溶液在48h内基本稳定。

2.4.7 重复性试验 取“2.4.2”项下2号样品贮备液，按供试品溶液的制备方法，制备5份供试品溶液，分别进样10μL，依法测定，结果盐酸小檗碱峰面积RSD值为1.06%，表明该方法重现性良好。

2.4.8 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品溶液1mL（0.0151 mg．mL-1），共6份，按《中国药典》2010年版一部附录XVIIIA项下方法，计算加入等量盐酸小檗碱对照品溶液，按上述色谱条件下测定，计算盐酸小檗碱的加样回收率。结果平均回收率99.91%，RSD值为1.38%（n=6），表明本品回收率符合要求。

2.4.9 样品测定 取供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.5 试验结果

依次测定每组苍术素及盐酸小檗碱含量，干膏收率，试验结果和结果分析见表2、表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

结果表明：根据综合评分结果，由直观分析可得影响提取效果的因素大小为：提取次数（C）＞乙醇浓度（B）＞乙醇用量（A）＞提取时间（D）；对实验数据进行方差分析结果表明，提取次数对苍术素、盐酸小檗碱量及干膏收率有显著性影响，乙醇浓度、乙醇用量和提取时间对苍术素、盐酸小檗碱量及干膏收率无显著性影响。综合直观分析和方差分析结果，结合工业化大生产节约能效，降低生产成本考虑，确定最佳提取工艺为A1B2C3D1，即加6倍量60%乙醇，提取3次，每次0.5小时。

2.6 验证试验

按正交试验筛选出的最佳提取工艺，重复试验3次，结果苍术素平均含量为3.249mg．g-1，盐酸小檗碱平均含量为4.066 mg．g-1，干膏平均收率为30.06%。三者的RSD值依次为0.96%，0.82%，0.69%，表明所确定的最佳工艺稳定，合理可行。

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

本试验在确定提取工艺的评价指标时，复方中苍术与关黄柏共为臣药，苍术素为主要且含量较多的有效成分，具有防止胃损伤、抗炎、利胆等作用[4]，所以作为评价指标之一，但其性质不稳定，遇光、热，易氧化分解[5]，定量分析会产生波动，故同时选择了关黄柏中主要有效成分盐酸小檗碱[6]作为指标。

3.2 提取溶剂的选择

本复方由13味药材组成，化学成分复杂，采用传统的提取工艺可能不能发挥其最好的临床疗效，故综合考虑药效与化学成分的性质，针对复方中苍术、关黄柏、川牛膝3味药材水溶性差的有效成分，故采用乙醇提取优选提取工艺。复方中其余10味药材其中的水溶性有效成分相对较多，因此选择水煎煮的提取工艺进行优选。

3.3 流动相的选择

在测定苍术素含量的过程中，试验分别比较了甲醇-水（79:21）和甲醇-水（80:20）两种不同的流动相，结果甲醇-水（80:20）效果较好，故选为流动相。

在测定盐酸小檗碱含量时，试验分别比较了乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0～20min,25%;20～40 min,25%～65%A;40～45min,65%～90%A;45min～50min, 90%A;50～65min,25%A）和乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（0～20min,73%A;20～25min,40%A;35～40min,9 0%A;40～45min,73%A），结果后者的效果更好，故选为流动相。

[1] 石书江,秦臻,孔松芝,等.苍术抗流感病毒有效成分的筛选[J].时珍国医国药,2012,23(3):565.

[2] 张冠英,董瑞娟,廉莲.川黄柏、关黄柏的化学成分及药理活性研究进展[J].沈阳药科大学学报,2012,29(10):812.

[3] 谭玉柱,陈宝华,李敏,等.川牛膝不同变种的品质评价[J].中成药,2012,34(9):1770.

[4] 周军,赵晨,王杰.藿香正气不同制剂中苍术素的含量测定[J].药物分析杂志,2012,32(8):1476.

[5] 张晓兰,李锦,李遇伯,等.高效液相色谱法测定茅苍术药材中β-桉叶醇与苍术素的含量[J].药物分析杂志,2009,29(12):2051.

[6] 喻志芳,孙璇.复方黄柏滴丸中关黄柏提取工艺研究[J].新疆中医药,2012,30(3):72.

（责任编辑： 胡慧玲）

Optimization of alcohol extraction technology of Tongfeng granules by orthogonal test

CHEN Zi-xian1, LI Jian-li1,2, LUO Yue1, WANG Li-jie1//(1.Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, China; 2.Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu, 610031, China)

Objective:To optimize the alcohol extraction condition of Tongfeng granules.Method:The optimum conditions were investigated by the L9(34) orthogonal design. With the content of atractylodin, berberine hydrochloride and yield of dry extract as indexes, orthogonal design was taken to investigate effects of the concentration of alcohol, the amount of alcohol, extraction time and times on extraction technology.Result:The optimal conditions were as following: refux extracted 3 times with 6 folds of 60% ethanol for 0.5 hours each time.Conclusion:This optimized process is stable and feasible, and it can be applied in industrial production.

Tongfeng granule; alcohol extraction technology; orthogonal design

R 283

A

1674-926X(2014)05-006-04

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.四川省中医药科学院中医研究所，四川 成都610031

陈梓贤（1990-），男，硕士研究生，主要从事中药新制剂、新剂型与新技术研究Tel:13458569717 Email:czxbangbang@163.com

李建利（1957-），男，教授，主任药师，硕士研究生导师，主要从事中药新制剂、新剂型与新技术研究Tel:15902833306 Email:menguan1005@163.com

2014-01-14