藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及系统进化分析

兰道亮, 王永, 张诚民, 李键, 汤承

（1.西南民族大学青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041）

藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及系统进化分析

兰道亮1, 王永1, 张诚民2, 李键1, 汤承2

（1.西南民族大学青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041）

为解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群组成及其基本生物学特征, 无菌采集12头健康藏绵羊新鲜粪便, 分离培养及纯化乳酸菌株, 并通过16S rDNA 序列扩增和测序进行分子鉴定. 结果显示: 从12个样本中共分离纯化出19株乳酸单菌,分属于7个属, 其中鹑鸡肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌及植物乳杆菌所占分离比例较多. 该结果为进一步了解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群种类及藏绵羊益生菌制剂的开发提供了基础.

藏绵羊; 乳酸菌; 分离培养; 16S rDNA

乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是指一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称[1].目前LAB 已发现共有43个属, 373个种和亚种, 其中常见的属有乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterooccus)、链球菌属(Streptooccus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)等[2]. 作为动物体益生菌的重要成员, LAB 广泛分布于动物体的口腔、泌尿生殖道及胃肠道内, 其中胃肠道中的LAB数量最为丰富, 且被证实具有排斥病原菌在肠壁的附着、抑制腐败和有毒物质的生成、分解毒物、降低胆固醇、调节机体免疫、促进排便及制造维生素等多种功能, 对人和畜禽的健康起着重要的保护作用[3-4], 同时也是微生态益生菌制剂研究的热点菌种.

藏绵羊(Tibetan sheep)是我国三大原始绵羊品种之一, 长期繁衍生息在平均海拔3000米以上的青藏高原及其毗邻的高寒牧区, 其对空气稀薄、严寒、牧草生长期短的高原恶劣生态环境具有良好的适应能力, 并为当地牧民提供主要的生产生活资料, 是目前高原地区不可或缺的重要畜种之一[5-6]. 藏绵羊由于其独特的生存环境及纯天然饲养放牧方式, 是名符其实的无污染绿色食品. 然而由于受粗放式经营管理的影响, 导致大多数高原地区的藏绵羊体格较小、体重下降、免疫力低下、疾病增多, 尤其是犊羊腹泻疾病在高原牧区广泛流行[7]. 尽管抗生素等药物的使用在维持动物健康、治疗个体疾病等方面发挥了重要的作用, 但其在疾病控制中所带来的诸如耐药性产生、有害残留和环境污染等问题也越发受到关注[8]. 因此, 抗生素等药物应在藏绵羊养殖业中少用和慎用,而利用藏绵羊益生菌制剂代替抗生素将是解决以上问题的有效方法之一. 目前, 对藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及与其遗传进化关系尚未见任何研究报道. 鉴于此, 本研究通过对藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及分子系统进化分析, 为进一步了解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群组成及藏绵羊益生菌制剂的开发提供基础.

1 材料与方法

1.1 样品采集

自若尔盖草原(平均海拔3500米, 东经102°08′至103°39′、北纬32°56′至34°19′之间)随机选取全天然放牧,健康, 生长发育正常的藏绵羊12头, 无菌采集约2g新鲜粪便, 迅速臵于含有MRS液体培养基的试管中, 冷藏后送实验室进行下一步分离.

1.2 菌株的分离与纯化

将未稀释的含粪便样的液体培养基直接涂布于含2.5%CaCO3的MRS固体平板, 且经30℃恒温培养24h后再涂一次平板, 以确保原始菌群无损失. 将制备好的平板臵于30℃恒温培养箱中培养24h左右, 定时观察并记录菌落特征, 挑取具有溶钙圈, 形态较小的单个菌落进行革兰氏染色镜检及初步生化反应. 选取革兰氏染色呈阳性, 过氧化氢酶阴性的无芽孢杆菌、球菌均暂定为乳酸菌. 然后上述菌种再次接种于MRS液体培养基, 于30℃恒温培养箱中培养24h左右, 重复几次以纯化分离的乳酸菌, 直至镜检结果为同一菌体形态后, 将其接种于MRS液体培养基中, 于30℃恒温培养24h左右用以增菌, 最后进行甘油保种.

1.3 分离株16S rDNA 序列扩增

取对数期的菌液, 离心后收集菌体, 采用CTAB法提取菌株基因组DNA. 16S rDNA序列扩增引物采用本实验室自行设计针对乳酸菌的通用引物: 16sTY3F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 16sTY3R-GGCTACCTTGTTA CGACTT, 目的扩增片段1400bp左右. PCR反应条件: 25 L的反应体系中含基因组DNA200 ng、 dNTP 0.2mmol/L、正反向引物各1 mmol/L、 Mg2+1.5mmol/L、10PCRBuffer2.5 L、Taq酶2U, 94℃预变性5min后进入循环: 94℃变性50s、 55℃退火45s 、72℃延伸90s, 30个循环后72℃延伸10min. 琼脂糖凝胶电泳检测产物的片段大小是否正确. 将检验正确的样品进行胶回收, 并送测序公司(华大基因, 深圳)进行测序.

1.4 16S rDNA序列分析及遗传进化树的构建

所得测序结果与GenBank数据库中已有的16SrDNA序列进行相似性比较分析, 在分子水平确定分离菌株的种属. 同时利用ClustalX2.0进行相关序列比对, 然后采用MEGA5.0软件绘制N-J系统发育树, 分析藏绵羊肠道乳酸菌的遗传进化关系.

2 结果与分析

2.1 分离菌株的革兰氏染色镜检结果

通过分离培养和纯化, 我们从12个粪便样本中共分离纯化出19株单菌. 通过革兰氏染色并镜检, 观察到所分离的菌为革兰氏阳性菌, 形态为球形或杆形, 呈单个成对或短链、长链状排列, 无鞭毛无芽胞, 符合乳酸菌属的基本形态特征.

2.2 16S rDNA序列扩增结果

对分离纯化的乳酸菌株进行16S rDNA序列PCR扩增, 以进一步在分子水平确定分离菌的种属. 扩增电泳检测结果如图1所示, 在1400bp处获得特异性条带, 与预期片段相符.

2.2 16S rDNA序列鉴定结果

进一步对分离纯化出的19株单菌的16S rDNA序列测定表明, 此19株分属于7个属, 其中5株属于鹑鸡肠球菌,4株属于海氏肠球菌, 4株属于粪肠球菌, 3株属于植物乳杆菌, 2株属于巴氏链球菌, 1株属于马蹄链球菌(表1).

2.3 遗传进化分析

参照序列比对结果, 从GenBank 中选取相关种属模式菌株16S rDNA序列与各分离菌株序列进行遗传进化树的构建, 结果如图2显示, 4株分离菌与海氏肠球菌聚为一类, 4株分离菌与粪肠球菌聚为一类, 5株分离菌与鹑鸡肠球菌聚为一类, 3株分离菌与植物乳杆菌聚为一类, 2分离菌与巴氏链球菌聚为一类, 而剩余1株则与马蹄链球菌聚为一个分支.此结果与序列比对鉴定结果相符, 进一步证明分离株所属乳酸菌属的正确性.

3 讨论

藏绵羊作为我国三大原始绵羊品种之一, 长期繁衍生息在平均海拔3000米以上的青藏高原地区,是目前高原地区分布最广数量最多的畜种之一[5-6]. 然而由于粗放纯天然的饲养放牧方式, 导致大多数高原地区的藏绵羊免疫力低下、易受疾病的侵袭, 特别是犊羊腹泻疾病在高原牧区广泛流行, 给藏绵羊养殖业造成了巨大损失[7].尽管抗生素等药物的使用在维持动物健康、治疗个体疾病等方面发挥了重要的作用, 但其在疾病控制中所带来的诸如耐药性产生、有害残留和环境污染等副作用也越发受到关注, 特别是对于无污染的青藏高原地区及绿色食品藏绵羊, 抗生素等药物则更应少用和慎用. 因此, 开发藏绵羊益生菌制剂显得尤为重要.

图1 16S rDNA 序列扩增电泳检测结果Fig.1 The electrophoresis test result of 16S rDNA sequence amplification

表1 16S rDNA序列比对鉴定结果Tab.1 The identification result by alignment of 16S rDNA sequences

图2 19株分离菌根据相关16S rDNA序列建立的遗传进化树Fig.2 The genetic evolutionary tree of 19 isolated bacteria strains in accordance with the 16S rDNA sequences

本实验首次对藏绵羊肠道乳酸菌进行了分离鉴定, 结果表明鹑鸡肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌及植物乳杆菌在藏绵羊肠道乳酸菌中分离比例较多, 其中球菌种类比杆菌种类较为丰富. 鹑鸡肠球菌是人、鸡、猪等多种动物肠道中的正常菌群, 因首次在鹑鸡的肠道中被分离出来而得名[9], 其产生的肠球菌素(enterocin)具有广谱抑菌作用[10], 也可以通过黏附拮抗效应有效维护宿主肠道健康. 但鹑鸡肠球菌目前还尚未在羊属动物中有过研究报道, 本实验首次证实鹑鸡肠球菌在藏绵羊肠道中也广泛存在. 海氏肠球菌与粪肠球菌广泛存在于人和动物的粪便中, 是动物胃肠道正常菌群之一, 其生长代谢速度快, 能抑制有害菌繁殖, 促进动物消化机能, 是目前国内外认可的饲用微生物[11-12], 此两类菌群的分离鉴定说明这两类菌也为藏绵羊肠道中的正常菌群之一. 除上述菌群外, 有趣的是我们发现植物乳杆菌在藏绵羊肠道乳酸菌中也占有较高的分离比例, 植物乳杆菌是一种主要常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌, 能通过胃并定植于肠道发挥有益作用[13], 但在动物体内并不常见, 而本实验显示藏绵羊肠道乳酸菌中的植物乳杆菌的分离比例较高, 但这是由于藏绵羊所食草类植物携带还是藏绵羊自身肠道具有, 还需进一步的实验证明. 综上研究结果为进一步了解藏绵羊肠道乳酸菌的菌群组成特征及藏绵羊益生菌制剂的开发奠定了基础.

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Isolation, identification and phylogenetic analysis of gut lactic acid bacteria from Tibetan sheep

LAN Dao-liang1, WANG Yong1, ZHANG Cheng-min2, LI Jian1, TANG Cheng2
(1.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau Research, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2.School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

To understand the flora composition and their biological characteristics of gut lactic acid bacteria in Tibetan sheep, 12 stools from healthy Tibetan sheep were collected sterilely, then the isolation and purification of lactic acid bacteria were performed, and the molecular identification was further determined by the amplification and sequencing of 16S rDNA sequence. The result showed that the total of 19 strains of lactic acid bacteria belonging to 7 genera were isolated from 12 samples, in which the Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, and Lactobacillus plantarum covered the advantage bacterium group. This study provides the basis for further understanding the gut lactic acid bacteria species in Tibetan sheep and value information for the development of probiotic preparations in Tibetan sheep.

Tibetan sheep; lactic acid bacteria; isolation; 16S rDNA

S858.26

A

1003-4271(2014)04-0481-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.01

2014-05-12

兰道亮(1984-), 男, 畲族, 江西德兴人, 副研究员, 博士, 研究方向: 胃肠道微生态、分子免疫学及动物功能基因组学.

汤承(1965-), 男, 教授, 博士, 研究方向: 病原微生物与分子免疫学; E-mail: tangcheng101@163.com.

国家科技支撑计划课题(2012BAD13B06).