异氟醚后处理降低新生大鼠缺血缺氧后脑损伤的机制研究

纪国余，薛杭，于威威，季海音，杨雅婷，赵平

（中国医科大学附属盛京医院麻醉二科，沈阳110004）

异氟醚后处理降低新生大鼠缺血缺氧后脑损伤的机制研究

纪国余，薛杭，于威威，季海音，杨雅婷，赵平

（中国医科大学附属盛京医院麻醉二科，沈阳110004）

目的探讨异氟醚后处理是否通过抑制线粒体通道转换孔（mPTP）的开放降低新生大鼠缺血缺氧后的脑损伤。方法新生SD大鼠210只，7 d龄，体质量12～16 g，采用随机数字表法，将大鼠随机均分为7组（n=30）：假手术组（Ⅰ组）、脑缺血缺氧组（Ⅱ组）、脑缺血缺氧+异氟醚后处理组（Ⅲ组）、苍术苷组（Ⅳ组）、苍术苷+异氟醚后处理组（Ⅴ组）、环孢素A组（Ⅵ组）、环孢素A+异氟醚后处理组（Ⅶ组）。除Ⅰ组外，其他各组均行左侧颈总动脉结扎手术，于37℃的水浴环境中，给予8%O2⁃92%N2混合气体处理2 h，制备新生大鼠缺血缺氧性脑损伤动物模型。各组于模型建立或假手术后，侧脑室注射苍术苷、环孢素A或生理盐水，然后将Ⅲ组、Ⅴ组、Ⅶ组放入半密闭箱内，持续吸入1.5%异氟醚（30%O2+70%N2）30 min；同时，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅵ组放入半密闭箱内，持续吸入不含异氟醚的混合气体（30%O2+70%N2）30 min，待大鼠苏醒后，放回笼中正常喂养。于脑缺血缺氧24 h后，各组随机取出10只，取脑组织，检测左侧大脑半球线粒体的吸光度变化，分析mPTP的开放；于缺血缺氧后7 d测定左、右大脑半球质量，计算左、右大脑半球质量比；计数丘脑腹后内侧核和海马CA3区左、右侧神经元数量，计算左、右侧神经元密度比。结果与Ⅰ组比较，Ⅱ组～Ⅶ组左侧大脑半球的质量、左右大脑半球质量比、丘脑腹后内侧核及海马CA3区左右正常神经元密度比值降低（P＜0.05），mPTP吸光度值的改变（△OD540nm）显著升高（P＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组、Ⅵ组及Ⅶ组左侧大脑半球的质量、左右大脑半球质量比、丘脑腹后内侧核及海马CA3区左右正常神经元密度比值升高（P＜0.05），mPTP的△OD540nm显著降低（P＜0.05）；与Ⅲ组比较，Ⅳ组和Ⅴ组左侧大脑半球的质量、左右大脑半球质量比、丘脑腹后内侧核及海马CA3区左右正常神经元密度比值降低（P＜0.05），mPTP的△OD540nm显著升高（P＜0.05）。结论异氟醚后处理降低缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的脑损伤程度；异氟醚后处理可以抑制缺血缺氧性脑损伤所致的mPTP开放；异氟醚后处理通过抑制mPTP的开放降低新生大鼠缺血缺氧后的脑损伤程度。

异氟醚后处理；缺血缺氧性脑损伤；线粒体通道转换孔；新生大鼠

异氟醚是广泛应用于临床麻醉的吸入麻醉药，具有诱导快、苏醒快、安全有效、易于操作等特点。研究认为，异氟醚后处理可以减轻缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的脑损伤［1～3］，而对其相关作用机制并不是十分清楚。在正常的细胞，线粒体通过氧化磷酸化提供能量，维持细胞生命活动。当缺血缺氧时，线粒体功能受损，产生的能量不足以维持细胞生存，最终可以导致细胞的坏死和凋亡，因此认为线粒体在细胞存活和死亡中起着关键作用，角色转换的开关就是线粒体通道转换孔（mitochondrial perme⁃ability transition pore，mPTP）。mPTP是横跨于线粒体内外膜之间非特异性、电压依赖性的特殊蛋白复合物。研究认为，线粒体功能状态是决定受损细胞存活或死亡的重要因素［4，5］，线粒体的功能障碍和不可逆损伤与mPTP的开放密切相关。本课题组前期实验结果显示异氟醚后处理可以抑制mPTP的开放，而异氟醚后处理对缺血缺氧脑损伤新大鼠的保护作用是否与异氟醚后处理抑制mPTP的开放有关，还有待进一步研究。本研究采用新生大鼠缺血缺氧性脑损伤动物模型，观察给予mPTP的开放剂和抑制剂后，异氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠脑保护作用的影响，进一步来探讨异氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的脑保护作用机制，为临床研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组

新生SD大鼠210只，7 d龄，体质量12～16 g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。采用随机数字表法，将大鼠随机均分为7组（n= 30）：假手术组（Ⅰ组）、脑缺血缺氧组（Ⅱ组）、脑缺血缺氧+异氟醚后处理组（Ⅲ组）、苍术苷组（Ⅳ组）、苍术苷+异氟醚后处理组（Ⅴ组）、环孢素A组（Ⅵ组）、环孢素A+异氟醚后处理组（Ⅶ组）。

1.2 方法

1.2.1 缺血缺氧性脑损伤新生大鼠模型的制备：参照Rice等［6］介绍的方法并加以改良制备缺血缺氧脑损伤动物模型。面罩吸入异氟醚维持麻醉，用7⁃0丝线2次永久结扎左颈总动脉，待大鼠清醒后，放回笼中继续喂哺2～3 h，然后将大鼠放入自制的半密闭箱中，箱内铺一层钠石灰吸收CO2和水蒸气，进气口连于装有异氟醚挥发罐的麻醉机，另一接口连接于气体监护仪，监测半密闭箱内气体浓度。半密闭箱置于水浴箱中，水浴箱温度设定为37℃，以2 L/min流量经进气孔向半密闭箱内持续输入8%O2⁃92%N2组成的湿化混合气体处理2 h。

1.2.2 侧脑室注射：缺血缺氧脑损伤动物模型制备后，参照Satoh等［7］介绍的方法，于复氧前行侧脑室注射，Ⅳ组、Ⅴ组侧脑室注射苍术苷（Atr，2 mmol/L）5 μL，Ⅵ组、Ⅶ组侧脑室注射环孢素A（CsA，2 μmol/L）5 μL，其他各组注射等量的生理盐水，注射速度约维持在2～3 μL/min，注射完毕后留针3～5 s，再缓慢退针，以防药物沿针道返流颅外。

1.2.3 异氟醚后处理：室温下，Ⅲ组、Ⅴ组、Ⅶ组的大鼠放入半密封箱内，吸入浓度为1.5%异氟醚（由30%O2⁃70%N2组成的湿化混合气体以2 L/min流量输送）30 min；Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅵ组的大鼠放入半密封箱内，只吸入30%O2⁃70%N2组成的湿化混合气体30 min。所有大鼠自然环境中恢复30 min后，放回母鼠身边继续喂哺。Ⅰ组除不结扎左颈总动脉和不吸入低氧气体外，处理措施与其他组相同。

1.2.4 线粒体提取及mPTP开放的测定：缺血缺氧后24 h，麻醉处死大鼠，在冰上快速断头取脑，用冷盐水冲掉脑组织表面的血迹滤纸吸干后，取左侧大脑半球，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内，加入1.5 mL冰冷的细胞裂解缓冲液（凯基线粒体提取试剂盒），0℃冰峪上下研磨组织20次，按线粒体提取试剂盒（凯基生物科技发展有限公司）进行操作提取线粒体，线粒体提取过程中始终在0～4℃下进行。线粒体的含量以所含的蛋白量表示，将提取的线粒体用GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒进行定量（杰美基因医药有限公司），最后将定量后的线粒体样品按照GENMED纯化mPTP比色法检测试剂盒（杰美基因医药有限公司）进行操作，使用酶标仪检测540 nm处脑组织线粒体吸光度值的变化，该值的变化反映线粒体肿胀程度，从而提示mPTP的开放和关闭程度。

1.2.5 新生大鼠死亡率及体质量的测定：在缺血缺氧后7 d，记录各组大鼠存活只数，计算各组的生存率；测量各组大鼠缺血缺氧前及缺血缺氧后7 d的体质量。

1.2.6 左右大脑半球质量比：缺血缺氧后7 d，新生大鼠于麻醉下打开腹腔暴露腹主动脉，将其剪断放血后，迅速断头取脑，用冷盐水冲洗脑组织表面的血迹，滤纸拭干，分离左右大脑半球并称重，计算左右大脑半球质量比。

1.2.7 脑损伤病理学检测：缺血缺氧后7 d，新生大鼠麻醉下心内灌注30 mL生理盐水后，再灌注30 mL 4%多聚甲醛，断头取脑，室温下放置在4%多聚甲醛中固定4 h。用冰冻切片机在前囟后3.3 mm处行冠状面切片，厚度为8 μm。于室温下晾干，行尼氏染色，中性树胶封片、晾干。400倍光镜显微镜下照相，从每张照片上，对应的左、右丘脑腹后内侧核及左、右海马CA3区随机各选择3个0.002 5 mm2范围，计数正常神经元数量，取平均值，计算左、右正常神经元的密度比。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠生存率及缺血缺氧前后体质量的比较

Ⅰ组生存率为100%，Ⅳ组生存率90.0%，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅴ组、Ⅵ组及Ⅶ组生存率均为95.0%；各组间生存率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d体质量的比较Tab.1 Body weights of neonatal rats

表1 各组新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d体质量的比较Tab.1 Body weights of neonatal rats

2.2 各组大鼠大鼠左右大脑半球质量及比值的比较

如表2所示，与Ⅰ组比较，Ⅱ组～Ⅶ组左侧大脑半球质量及左、右大脑半球质量比值显著降低（P＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组、Ⅵ组及Ⅶ组左侧大脑半球质量及左、右大脑半球质量比值显著升高（P＜0.05）；与Ⅲ组比较，Ⅳ组和Ⅴ组左侧大脑半球质量及左、右大脑半球质量比值显著降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠左右大脑半球质量及比值的比较Tab.2 Weight ratio of left/right hemisphere

表2 各组大鼠左右大脑半球质量及比值的比较Tab.2 Weight ratio of left/right hemisphere

1）P＜0.05 vs groupⅠ；2）P＜0.05 vs groupⅡ；3）P＜0.05 vs groupⅢ.

2.3 各组大鼠丘脑腹后内侧核及海马CA3区左、右侧正常神经元密度比结果（图1、2，表3）

图1 各组大鼠缺血缺氧后7 d丘脑腹后内测核神经元病理改变Nissl染色×400Fig.1 Pathological changes of ventral posterior inferior thalamic nucleus at 7 d after hypoxic/ischemia Nissl staining×400

图2 各组大鼠缺血缺氧后7 d海马CA3区神经元病理改变Nissl染色×400Fig.2 Pathological changes of hippocampus CA3 at 7 d after hypoxic/ischemia Nissl staining×400

与Ⅰ组比较，Ⅱ组～Ⅶ组丘脑腹后内侧核及海马CA3区左、右侧正常神经元密度比值显著降低（P＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组、Ⅵ组及Ⅶ组丘脑腹后内侧核及海马CA3区左、右侧正常神经元密度比值显著升高（P＜0.05）；与Ⅲ组比较，Ⅳ组和Ⅴ组丘脑腹后内侧核及海马CA3区左、右侧正常神经元密度比值则显著降低（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠mPTP的吸光度值结果

Ⅰ组～Ⅶ组的吸光度值（△OD540nm）分别为0.087±0.038、0.237±0.062、0.173±0.039、0.254± 0.048、0.233±0.049、0.181±0.049、0.178±0.036。与Ⅰ组比较，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅶ组大鼠mPTP的△OD540nm显著升高（P＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组、Ⅵ组及Ⅶ组大鼠mPTP的△OD540nm显著降低（P＜0.05）；与Ⅲ组比较，Ⅳ组和Ⅴ组大鼠mPTP的△OD540nm显著升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠丘脑腹后内侧核及海马CA3区左、右侧正常神经元密度比Tab.3 The normal neuronal density ratio in ventral posterior inferior thalamic nucleus and hippocampus CA3 of left/right cerebral hemisphere

表3 各组大鼠丘脑腹后内侧核及海马CA3区左、右侧正常神经元密度比Tab.3 The normal neuronal density ratio in ventral posterior inferior thalamic nucleus and hippocampus CA3 of left/right cerebral hemisphere

1）P＜0.05 vs groupⅠ；2）P＜0.05 vs groupⅡ；3）P＜0.05 vs groupⅢ.

3 讨论

本课题组前期实验结果表明，缺血缺氧性脑损伤新生大鼠，在脑缺血缺氧6 h内吸入1.5%异氟醚30 min后，可以减轻缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的脑损伤程度［2，3］，对脑损伤的新生大鼠具有脑保护作用。研究还认为异氟醚后处理可能通过抑制缺血缺氧性脑损伤所致的mPTP开放，降低缺血缺氧后脑细胞的死亡或凋亡，从而实现对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的脑保护作用。本研究结果显示，缺血缺氧性脑损伤的新生大鼠给予mPTP的特异性抑制剂（环孢素A）后，可以模拟异氟醚后处理，对缺血缺氧性脑损伤的新生大鼠具有脑保护效应，但是，异氟醚后处理和环孢素A对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的脑保护并没有呈现出2者有叠加作用。本实验结果还显示，给予mPTP的特异性开放剂苍术苷后，其可以逆转异氟醚后处理的脑保护效应。

线粒体是细胞的能量代谢中心，对细胞的生存和死亡起着至关重要的作用。线粒体作为一个结构和功能复杂而敏感的细胞器，对缺血缺氧非常敏感，缺血缺氧严重时可以引起细胞凋亡或坏死。正常情况下线粒体由两层膜结构组成，外膜通透性较高，内膜通透性相对较低，而mPTP是横跨于线粒体内外膜之间非特异性、电压依赖性的特殊蛋白复合物，主要由线粒体内膜上的腺嘌呤核苷转运蛋白（adenine nucleotide translocator，ANT）、线粒体外膜的电压依赖的阴离子通道（voltage⁃dependent anion channel，VDAC）、线粒体基质的亲环蛋白D（cyclophilin D，CyP⁃D）以及其他蛋白物质等共同组成［8～10］。环孢素A作为mPTP的特异性抑制剂，可以阻止CyP⁃D与ANT结合，从而抑制mPTP的开放；然而，ANT的配体苍术苷（mPTP的开放剂）可以通过防止构象的改变，从而逆转环孢素A对mPTP的作用［11，12］。mPTP开放时，引起线粒体基质肿胀，导致线粒体渗透性增加，肿胀液中的溶质内流入线粒体基质，引起线粒体膨胀，外膜破裂，从而使得线粒体体积增大，对光的通透性增加。线粒体肿胀是mPTP开放最直接的表现，mPTP开放越高，线粒体肿胀得越明显。文献报道mPTP开放度的测定可以采用可见光分光度法［13］，来测定540 nm处线粒体吸光度值的改变［14，15］，分析和观察脑组织mPTP的开放。本研究结果显示，给予环孢素A后，缺血缺氧性脑损伤新生大鼠脑组织mPTP的吸光度值的改变明显降低，这与异氟醚后处理具有相同的作用效果，但是环孢素A并没有增加异氟醚后处理抑制mPTP的吸光度值的改变；而给予苍术苷后，缺血缺氧性脑损伤新生大鼠脑组织mPTP的吸光度值的改变明显升高，表明了苍术苷可以逆转异氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠脑组织mPTP的吸光度值的改变。研究显示丘脑腹后内侧核和海马是缺血缺氧后最易受损的部位［3，16］，其神经元细胞对缺血缺氧非常敏感。有文献报导抑制mPTP的开放则有助于减轻中枢神经系统神经元损伤［9］。本课题组前期实验显示，吸入1.5%的异氟醚30 min，缺血缺氧后7 d时，脑损伤新生大鼠左侧丘脑腹后内侧核和海马CA3区正常神经元密度明显增加，表明1.5%异氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠有神经元保护作用。本研究结果显示，给予苍术苷的大鼠正常神经元数较单纯给予异氟醚后处理的大鼠明显降低，而给予环孢素A的大鼠正常神经元数与单纯给予异氟醚后处理的大鼠基本一致，表明了环孢素A对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的神经元细胞有保护作用，而苍术苷可以逆转异氟醚后处理的保护作用。

综上所述，我们可以认为异氟醚后处理通过抑制缺血缺氧性脑损伤所致的mPTP开放对缺血缺氧脑损伤新大鼠产生脑保护作用，而异氟醚后处理的脑保护作用是否有其他机制参与还有待于进一步研究。

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（编辑 武玉欣）

Mechanism Study of Isoflurane Postconditioning on Reducing Hypoxic⁃ischemia Brain Injury in Neonatal Rats

JI Guo⁃yu，XUE Hang，YU Wei⁃wei，JI Hai⁃yin，YANG Ya⁃ting，ZHAO Ping
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate whether isoflurane postconditioning reduce hypoxic⁃ischemia brain injury by inhibiting the openness of mito⁃chondrial permeability transition pore（mPTP）in neonatal rats.MethodsTwo hundred and ten 7⁃day⁃old Sprague⁃Dawley（SD）rats，weighing 12⁃16 g，were randomly divided into 7 groups（n=30 pergroup）：sham surgery group（groupⅠ），hypoxic ischemia brain injury（groupⅡ），isoflu⁃rane inhalation after hypoxic ischemic brain damage group（groupⅢ），Lateral cerebral ventricle injection of atractyloside group（groupⅣ），iso⁃flurane inhalation after lateral cerebral ventricle injection of atractyloside group（groupⅤ），lateral cerebral ventricle injection of cyclosporine A group（groupⅥ）and isoflurane inhalation after lateral cerebral ventricle injection of cyclosporine A group（groupⅦ）.To establish hypoxic isch⁃emic brain damage model in neonatal rats，pups with left common carotid arterial ligation were followed by exposure to 8%O2+92%N2for 2 h with 37℃water bath.The model（or control）groups were injected with atractyloside，cyclosporine A or physiological saline in lateral cerebral ventricle after hypoxic ischemic brain damage.In Ⅲ，Ⅴ and Ⅶgroups，1.5% isoflurane were inhaled for 30 min after hypoxic ischemia brain damage，while the other groups were exposed to 30%O2and 70%N2for 30 min.24 h after brain hypoxia/ischemia，10 rats were randomly selected from each group to measure activity of mitochondrial permeability transition pore.The survival rates of the rest rats at7 days were recorded and calculated.Brains were removed and the right and the left cerebral hemispheres were weighed separately.Ratio of left/right cerebral hemisphere was calculated.The normal neuronal density in ventral posterior inferior thalamic nucleus and hippocampus CA3 of left and right cerebral hemisphere were measured and normalneuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were calculatedResultsCompared with groupⅠ，the weight of left cerebral hemisphere，ratios of left/right cerebral hemisphere，normal neuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were significantly decreased and mPTP△OD540nmwas significantly increased in groups Ⅲ⁃Ⅶ（P＜0.05）.Compared with group Ⅱ，the weight of left cerebral hemisphere，ratios of left/right cerebral hemisphere，normal neuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were significantly increased and mPTP△OD540nmwas signifi⁃cantly decreased in groups Ⅲ，Ⅵ and Ⅶ（P＜0.05）.Compared with group Ⅲ，the weight of left cerebral hemisphere，ratios of left/right cerebral hemisphere，normal neuronal density ratios of left to right cerebral hemisphere were significantly decreased and mPTP△OD540nmwas significantly in⁃creased in groups Ⅵ and Ⅴ（P＜0.05）.ConclusionIsoflurane postconditioning reduced hypoxic ischemic brain injury in neonatal rats and inhibit⁃ed the openness of mPTP.Isoflurane postconditioning might inhibit mPTP openness to reduce hypoxic ischemic brain injury in neonatal rats.

isoflurane postconditioning；hypoxic ischemia brain injury；mitochondrial permeability transition pore；neonatal rat

R614.2

A

0258-4646（2014）07-0592-06

国家自然科学基金（81171782）

纪国余（1985-），男，硕士研究生.

赵平，E-mail：zhaop@sj⁃hospital.org

2014-04-08

网络出版时间：