骨形成蛋白受体ⅠA在晶状体内条件敲除后对胚眼晶状体发育的影响

赵琪，赵江月，张劲松

（1.大连医科大学附属二院眼科，辽宁大连116023；2.中国医科大学附属第四医院眼科，沈阳110032）

骨形成蛋白受体ⅠA在晶状体内条件敲除后对胚眼晶状体发育的影响

赵琪1，赵江月2，张劲松2

（1.大连医科大学附属二院眼科，辽宁大连116023；2.中国医科大学附属第四医院眼科，沈阳110032）

目的通过研究骨形成蛋白受体ⅠA（BMPRⅠA）基因在晶体内条件敲除小鼠中的作用，阐述胚胎发育过程中BMPRⅠA在胚眼晶状体发育中产生的影响。方法采用BMPRⅠA基因在晶体内条件敲除的小鼠alk3fl/fl；lecre和alk3fl/+；lecre，母鼠alk3fl/fl配公鼠lecre alk3fl/+或者母鼠alk3fl/+配公鼠lecre alk3fl/fl产生实验组lecre alk3fl/fl（3只），对照组为lecre alk3fl/+（3只）。提取鼠尾DNA，然后进行基因型鉴定，取胚胎固定，石蜡包埋，HE染色。接下来进行免疫荧光检查，一抗是sc-9305 bmp7，二抗是IF-0314 aG0IgG/FITC，荧光镜下观察。结果BMPRⅠA晶体内条件敲除的小鼠与对照组比较，晶体的形态学变化差异从E13.5 d开始可以分辨，在E15.5 d已经有显著差异，但实验组和对照组均有晶体的发育。在BMPRⅠA晶体内条件敲除的小鼠中，骨形成蛋白7（BMP7）在晶体内的表达显著减少，尤其在胚胎发育的中后期（E13.5 d～E15.5 d）；而对照组中BMP7的表达不受影响。结论BMPRⅠA在晶体的发育过程中起重要的调节作用，其在晶体内条件敲除可以导致晶体发育不良，但不会导致晶体的缺失。BMP7在胚胎发育过程中表达于晶体中，而且其表达受BMPRⅠA的影响。

骨形成蛋白受体ⅠA；骨形成蛋白7；晶状体；胚胎发育

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）家族成员之一，除了在骨和软骨的发育及诱导异位骨和软骨发生的过程中具有重要作用外，还有调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学作用［1］，BMP几乎在所有发育中的组织和器官的分化和形成中起关键作用。眼组织源于神经外胚叶、表皮外胚叶和中胚叶，发育过程复杂，并存在各组织间的相互作用，多种BMP成员及相应细胞因子参与其发育。在BMP传递信号路径中，其发挥功能要通过结合跨膜丝氨酸苏氨酸激酶受体实现［2］。BMP有两种受体，受体Ⅰ和受体Ⅱ，都是二聚体（是相同的二分子二聚体），具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性。这两种受体很相似，它们位于细胞外，有简短的、含有丝-苏氨酸保守序列的结构域，这是一个信号接受的区域，相对应于这一接受区域，在细胞内含有一段具丝氨酸-苏氨酸激酶活性的区域（一个具有重复的甘氨酸和丝氨酸的氨基酸序列）［3］。在哺乳动物中，已经鉴定了7种Ⅰ型受体和5种Ⅱ型受体，Ⅰ型受体决定了信号传递的特异性，BMPⅠ型受体又可分骨形成蛋白受体ⅠA（bone morphogenetic protein receptorⅠA，BMPRⅠA，又名ALK3）、BMPRⅠB（又名ALK6）、ACTRⅠA（又名ALK2）等，Ⅱ型受体包括ACVRⅡA、ACVRⅡB、BMPR2［4］。

TGF-β超家族传导的信号途径主要有两条，即Smad途径和由TAK1介导的p38MAPK途径。Smad途径主要与细胞分化有关，而TAK1途径则主要和细胞凋亡有关［5］。转录因子ATF2是AKT1和Smad共同的下游信号分子。有研究发现BMPRⅠA等活化的Smad1能通过降低ATF2的活性而负调控p38MAPK调节通路，而由TAK1介导的p38MAPK途径是BMPRⅠA下游信号转导通路之一，主要与细胞凋亡有关［6，7］，故BMPRⅠA基因敲除时p38MAPK介导的凋亡通路可能被正调控而活化。在胚胎时期，细胞凋亡是保证个体正常发育所必需的，但若细胞凋亡规律失常，个体发育也将出现异常甚至引起死亡［8］。晶状体、神经管发育分化过程中，转录因子Pax6、Six3、Sox2受成纤维细胞生长因子和BMP信号的调控［9］。研究发现BMP通过调节Pax及HLH基因表达来调节背腹神经管、中间神经管的发育分化，从而对眼组织发育、分化产生重要影响［10］。本研究对BMPRⅠA在晶状体内条件敲除后晶状体发育所发生的变化进行观察，从而丰富晶状体的发育规律，对将来进一步了解胚眼的发育诱导有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料及分组：实验用BMPRⅠA基因条件敲除小鼠alk3fl/fl；lecre和alk3fl/+；lecre。由美国南加州大学惠赠，在中国医科大学SPF级实验动物中心繁育、饲养。雌雄按2∶1比例合笼，母鼠alk3fl/fl配公鼠lecre alk3fl/+或者母鼠alk3fl/+配公鼠lecre alk3fl/fl，产生实验组lecre alk3fl/fl，对照组为lecre alk3fl/+。每天早6点观察雌鼠阴部，将发现有阴道栓的孕鼠分笼饲养，并记做胚胎天数为0.5 d（E0.5 d），标签注明怀孕日期。取胎龄E13.5 d、E15.5 d的小鼠胚胎作为实验材料。实验组和对照组各3只，获取胚鼠眼球，4%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片备用。

1.1.2 主要试剂：一抗：SC-9305 bmp7（羊源抗体），二抗：IF-0314 aG0IgG/FITC，均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 组织包埋：在胚胎天数达到E13.5 d、E15.5 d时，取不同孕期的孕鼠，分组标记，分别断髓处死，浸入75%乙醇消毒3 min，然后取出孕鼠放入一干净平皿中，无菌条件下剖腹取出胚胎（同期胚胎不少于6～12个），撕去胎囊，小心用眼科剪镊分离出胚胎，并移至另一消毒平皿中，其中预先放冰PBS液，DEPC-PBS洗2次，鼠尾另作保留用于PCR，4%PFA固定，过夜，石蜡包埋。

1.2.2 PCR鉴定基因型：把胎鼠的编号标好，取鼠尾做PCR，引物设计：Cre-FP：TAATCGCCATCTTCCAG CAG；Cre-RP：CTCTGGTGTAGCTGATGATC；ALK3-FX2：GCAGCTGCTGCTGCAGCCTCC；ALK3-FX4：TGGCTACAATTTGTCTCATGC，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系共计20 μL：2.0 μL的10×Buffer，1.6 μL的5 mmol/L Mg-Cl，1.6 μL的25 mmol/L dNTP，0.7 μL的10 μmol/L OVG34，0.7 μL的10 μmol/L OVG35，0.5 μL的10 μmol/L MHC-5，0.5 μL的10 μmol/L Cre-3，0.1 μL的Taq，0.8 μL的DNA，再加ddH2O 11.5 μL补足。PCR反应条件：94℃预变性5 min，然后94℃变性1 min，再60℃退火1 min，72℃再延伸1 min，上述循环共38个，最后72℃延伸10 min。基因型鉴定：取PCR反应终产物5 μL，用2%琼脂糖凝胶电泳，以Golden view作为分子质量标记物。小鼠尾部组织琼脂糖凝胶电泳基因型片段：基因缺失型130 bp，纯合子130 bp和350 bp，杂合子350 bp，检测出的130 bp条带为基因片段alk3fl/-；检测出的350 bp条带为基因片段Cre，按此基因条带可以鉴别出各个基因型小鼠。

1.2.3 HE染色：烤片30 min，然后二甲苯浸泡10 min，无水乙醇浸泡5 min（无水乙醇量要大于二甲苯量），95%乙醇浸泡5 s，90%乙醇浸泡5 s，80%乙醇浸泡5 s，自来水冲洗。苏木精浸泡5～10 min，自来水冲洗，伊红浸泡2～3 min，自来水冲洗，95%乙醇浸泡数秒，无水乙醇浸泡5 min，二甲苯浸泡10 min，擦干液体，封片，光学显微镜下观察。

1.2.4 免疫荧光：石蜡切片常规脱蜡，枸橼酸缓冲洗，微波抗原修复，蒸馏水冲洗，PBS浸泡3 min×2次，4%过氧化氢室温孵育20 min以清除内源性过氧化物酶的活性。PBS浸泡3 min×2次，正常羊血清室温孵育20 min，封闭非特异性抗原，吸去羊血清，然后加入一抗SC-9305 bmp7（羊源抗体），稀释比1∶10，4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入二抗IF-0314 aG0IgG/FITC（抗羊），稀释比1∶500，避光孵育1 h， PBS洗3次，磷酸甘油封片，荧光镜下观察，以PBS替一抗作为阴性对照。

2 结果

2.1BMPRⅠA晶体内条件敲除后晶状体的形态学变化

BMPRⅠA在晶体的发育过程中起重要的调节作用，但BMPRⅠA的缺失并不会导致晶体发育的缺失。实验组与对照组比较，晶体的形态学变化差异从E13.5 d开始可以分辨，在E15.5 d已经有了显著差异，但实验组和对照组均有晶体的发育。胚眼组织石蜡切片后，HE染色结果见图1。

图1 眼球切片HE染色×20Fig.1 Section of the embryonic eyes was stained with HE×20

2.2BMPRⅠA晶体内条件敲除后BMP7在晶体内的表达变化

BMP7在胚胎发育过程中表达于晶体中，而且其表达受BMPRⅠA的影响。对于实验组，BMP7在晶体内的表达显著减少，尤其在胚胎发育的中后期（E13.5 d～E15.5 d）；而在对照组中BMP7的表达则不受影响。胚眼组织石蜡切片后，免疫荧光检查的结果见图2。

图2 眼球切片BMP7表达的免疫荧光染色×20Fig.2 The BMP7 expression was detected in sections of embryonic eyes by immunofluorescence assay×20

3 讨论

晶体的发育最初起自晶体基板——与视泡相接触的表皮外胚层的增厚，晶体基板形态学上的明显形成与特定的组织优先蛋白（晶状体蛋白）的表达同时发生。晶状体蛋白在晶体中的高水平表达，对晶体透明度的产生和维持是必要的，晶体基板和视泡的一致性内陷导致了晶体泡和双层视杯的形成，视杯的内层形成神经视网膜，外层形成视网膜色素上皮，当晶体基板从表皮外胚层分离形成晶体泡时，晶体泡上面的表皮外胚层就形成了未来的角膜上皮［11］。晶体泡好似一个球形体，有一个很大的中央腔，腔内充满原始的晶体纤维细胞，其来自于晶体泡后部的延伸，晶体泡前部的细胞将形成晶体上皮细胞，晶体上皮中央区域分裂活跃的细胞向中纬线部移行，它们再延伸，分化为二级晶体纤维，最后分化截止的晶体纤维细胞失去了细胞器，从而使晶体透明［12］。

晶状体是研究哺乳动物发育的理想系统，与周围组织相对隔离，特别是细胞成分单纯，由晶状体囊膜、晶状体上皮细胞和最终分化形成的晶状体纤维组成，其前囊后方是一单层上皮细胞，上皮细胞发生有丝分裂，新生的细胞向赤道部移行，同时开始了晶状体纤维分化过程，晶状体纤维细胞由上皮细胞伸长形成。很多晶状体蛋白基因几乎仅仅在晶状体细胞表达，因此可以应用这些基因的转录启动子制备转基因动物模型［13］。所以晶状体活体模型将排除体外实验的各种干扰因素，为研究细胞周期动力学与组织分化提供了一个独一无二的机会。

BMP/TGF-β通路：BMP/TGF-β信号传导通路调控晶体发育的多个阶段，大量BMP和TGF-β配体以及它们的跨膜苏氨酸激酶受体被表达在晶体和外周组织，在与配体结合之上，在Ⅰ型和Ⅱ型受体二聚体之间形成一个复合物，伴随着Ⅱ型受体转磷酸化Ⅰ型受体［14］。被激活的Ⅰ型受体与衔接蛋白相互作用，可招募Smad蛋白，在TGF-β级联反应中细胞质Smad2和Smad3被磷酸化，形成有共同介质Smad4的细胞质复合物，随后转移入细胞核。在BMP通路，磷酸化的Smad1/4/5与Smad4粘连。通过识别Smad结合位点，Smad4/Smad3或Smad4/Smad能激活或抑制转录，此转录依赖于它们相互联系的染色质重建酶，交替的信号传导级联能经过细胞膜RAS和它的下游目标ERK1/2介导，或者经过TAK1/ MFKK1激酶产成活性JNK和P38激酶，这一通路的负调控物包括晶状体蛋白限局性抑制的Smad5、Smad6和Smad7［15］。BMP/TGF-β通路在一定的细胞背景里进行相应的操作。与不同BMP/TGF-β因子相结合的受体的时空调节以及磷酸化Smads的分布对这一通路的机制分析提供了策略。鸡和老鼠的实验显示晶体纤维细胞的延伸被一个BMP配体抑制剂所抑制［16］。原始晶体纤维的分化也被ALK6的显性阴性形式的过表达所抑制。BMPRⅠA的失活在预期的晶体外胚层中导致了缺陷，此缺陷促成了受体在纤维细胞分化后期和晶体上皮细胞增殖与存活中的作用。BMP和TGF-β配体不只被其他的眼部细胞产生去调节晶体纤维细胞的分化，晶体本身也能作为TGF-β通路中心去控制来源于中枢神经区的眼部组织的发育［17］。

小鼠胚胎发育过程中BMP7表达于众多胚胎组织，尤其是上皮细胞和间充质细胞相互作用介导的组织发育。眼组织源于神经外胚叶、表皮外胚叶和中胚叶，发育过程复杂，并存在各组织间的相互作用。BMP几乎与所有眼组织发育密切相关，尤其是晶状体和视网膜，涉及复杂的信号和组织间的相互作用，是研究的重点［18］。多项研究发现BMP7是视泡发出的晶状体板和角膜上皮细胞的诱发信号分子，一些学者对发育早期视网膜、晶状体与BMP三者之间的关系进行研究与推测：在发育早期视网膜产生BMP7和BMP结合蛋白，假想其均分泌至玻璃体，晶状体依赖BMP7诱发。

本实验的结果证明了BMPRⅠA在晶体的发育过程中起重要的调节作用，但BMPRⅠA的缺失并不会导致晶体发育的缺失。BMPRⅠA晶体内条件敲除的小鼠随着胚龄的增加其晶体的形态学变化日益明显，虽然有晶体的发育，但发育不良、形态缺陷明显［19］。BMP7在胚胎发育过程中表达于晶体中，我们观察到其表达一定程度上受BMPRⅠA的影响，在BMPRⅠA晶体内条件敲除的小鼠中，BMP7在晶体内的表达显著减少，尤其在胚胎发育的中后期。本实验为胚胎诱导的学说提供了一定的实验依据，进行了有意义的尝试。关于BMPRⅠA和BMP7之间的具体作用机制，我们还需要在将来的研究中进一步探讨。

［1］Gilboa L，Nohe A，Geissendorfer T.Bone morphogenetic protein receptor complexes on the surface of live cells：a new oligomerization mode for serine/threonine kinase receptors［J］.Mol Biol Cell，2000，11（3）：1023-1035.

［2］Nohe A，Hassel S，Ehrlich M.The mode of bone morphogenetic protein（BMP）receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways［J］.J Biol Chem，2002，277（7）：5330-5338.

［3］Aoki H，Fujii M，Imamura T.Synergistic effects of different bone morphogenetic protein typeⅠreceptors on alkaline phosphatase induction［J］.J Cell Sci，2001，114（8）：1483-1489.

［4］Massague J，Seoane J，Wotton D.Smad transcription factors［J］. Genes Dev，2007，19（23）：2783-2810.

［5］Wada T，Penninger JM.Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation［J］.Oncogene，2004，23（16）：2838-2849.

［6］Knockaert M，Sapkota G，Alarcon C.Unique players in the BMP pathway：small C-terminal domain phosphatases dephosphorylate Smad1 to attenuate BMP signaling［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（32）：11940-11945.

［7］Kimura N，Matsuo R，Shibuya H.BMP-2 induced apoptosis is mediated by activation of the TAK1-p38 kinase pathway that is negatively regulated by Smad6［J］.J Biol Chem，2000，275（23）：17647-17652.

［8］Olson JM，Hallahan AR.p38 MAP kinase：a convergence point in cancer therapy［J］.Trends Mol Med，2004，10（3）：125-129.

［9］Balemans W，Van Hul W.Extracellular regulation of BMP signaling in vertebrates：a cocktail of modulators［J］.Dev Biol，2002，250（2）：231-250.

［10］Shimasaki S，Moore RK，Otsuka F.The bone morphogenetic protein system in mammalian reproduction［J］.Endocr Rev，2004，25（1）：72-101.

［11］Ashery-Padan R，Marquardt T，Zhou X，et al.Pax6 activity in the lens primordium is required for lens formation and for correct placement of a single retina in the eye［J］.Genes Dev，2000，14（21）：2701-2711.

［12］Dudas M，Sridurongrit S，Nagy A，et al.Craniofacial defects in mice lacking BMP typeⅠreceptor Alk2 in neural crest cells［J］. Mech Dev，2004，121（2）：173-182.

［13］Truett GE，Heeger P，Mynatt RL，et al.Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris（Hot-SHOT）［J］.Biotechniques，2000，29（1）：52-54.

［14］Stratman JL，Barnes WM，Simon TC.Universal PCR genotyping assay that achieves single copy sensitivity with any primer pair［J］. Transgenic Res，2003，12（4）：521-522.

［15］Wawersik S，Purcell P，Rauchman M，et al.BMP7 acts in murine lens placode development［J］.Dev Biol，1999，207（1）：176-188.

［16］Furuta Y，Hogan BL.BMP4 is essential for lens induction in the mouse embryo［J］.Genes Dev，1998，12（23）：3764-3775.

［17］Ashery-Padan R，Marquardt T，Zhou X，et al.Pax6 activity in the lens primordium is required for lens formation and for correct placement of a single retina in the eye［J］.Genes Dev，2000，14（21）：2701-2711.

［18］Beebe D，Garcia C，Wang X，et al.Contributions by members of the TGFbeta superfamily to lens development［J］.Int J Dev Biol，2004，48（8）：845-856.

［19］Mishina Y.Function of bone morphogenetic protein signaling during mouse development［J］.Front Biosci，2003，1（8）：855-869.

（编辑陈姜）

Influence of Bone Morphogenetic Protein ReceptorⅠA Conditional Knockout in Lens during Embryonic Eye De⁃velopment

ZHAOQi1，ZHAOJiang-yue2，ZHANGJin-song2
（1.DepartmentofOphthalmology，Second Affiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116023，China；2.DepartmentofOphthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo study the process of embryonic development from protein and molecular biology level，and investigate the function of Bone Morphogenetic Protein ReceptorⅠ（BMPRⅠ）A during development of the vertebrate eye.MethodsAlk3fl/fl lecre and alk3fl/+lecre mice which hasBMPRⅠAconditionalknockoutin lensregion were used in this experiment.3 Cre-positive（conditionalknockout，CKO）and 3 Cre-negative offspring（WT）were generated by mating Cre-positive mice with Cre-negative mice.Embryos were fixed and embedded in paraffin.Sections were processed for hematoxylin and eosin staining.In immunofluorescence analysis，primary antibody sc-9305 bmp7 was used for immunofluorescence detection.IF-0314 aG0IgG/FITC was adopted as secondary antibody.The bright field images and the fluorescent images were obtained.Re⁃sultsComparing the BMPRⅠA lens conditional knockout mice with the control subjects，morphological difference of lens was first observed in E13.5，and significant differences were present in the E15.5 d，but both the experimental group and control group showed lens growth.In the mice ofBMPRⅠAlens conditionalknockout，bone morphogenetic protein 7（BMP7）expression was significantly reduced in lens，especially in the laterperiod of the embryonic development（E13.5 d-E15.5 d）；while BMP7 expression was not affected in the control group.ConclusionBMPRⅠAplayed an important regulatory role in development of lens，the loss ofBMPRⅠAresulted in dysplasia and morphological defects，but did not cause the lack oflens formation.Bone morphogenetic protein 7 expressed in lens during embryogenesis，and its expression wasinfluenced byBMPRⅠA.

BMPRⅠA；bone morphogenetic protein 7；lens；embryonic development

R321

A

0258-4646（2014）03-0209-05

国家自然科学基金（30872836）；辽宁省自然科学基金（201102054）

赵琪（1971-），男，主任医师，博士. E-mail：zhaoqi0219@126.com

2013-12-16

网络出版时间：