上转换技术应用于生物传感器的构建

田静菡，宁保安，张娜，彭媛，白家磊，赵玉凤，高志贤

（军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050）

上转换技术应用于生物传感器的构建

田静菡，宁保安，张娜，彭媛，白家磊，赵玉凤，高志贤*

（军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050）

上转换材料可通过非线性的光学过程将低能量的激发光源转化成高能量的近红外或可见光辐射，组织穿透性强，生物兼容性好，产生的背景信号较低、斯托克斯位移较大、发射峰窄、几乎没有光漂白性，是近年来取得飞速发展与应用的荧光材料。本文对上转换材料的合成、表面修饰、应用等最新进展进行阐述。本实验室成功合成了有机相的上转换纳米颗粒，并基于此材料构建传感器应用于食品样品中双酚A的检测。

上转换；荧光材料；表面修饰；生物传感器；双酚A

上转换发光（Upconverting Technology，UPT）是指稀土离子吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子的发光现象。上转换发光材料主要是掺杂稀土元素的固体化合物，通常由基质材料、激活剂、敏化剂组成。利用稀土元素离子亚稳态的能级在光激发过程中发生反斯托克斯效应。上转换放光纳米颗粒（upconversion nannparticles，UCNPs）相对于块体材料有更好的发光效率和水溶性，在生物成像，药物载体，生物传感器等领域有着巨大的应用前景[1-3]。本文对上转换材料的发光机理，合成方法，表面修饰和最新的应用进展进行了阐述。

1 上转换机理及材料的合成

上转换过程是由低能量的电子激发而产生高能量发射的非线性过程，由于过程为双光子或多光子过程，违背斯托克斯定律，因而也成为反斯托克斯过程[4]。其机制可分为三大类：激发态吸收（excited stateabsorption ESA），能量转移（energy transfe ET）和光子雪崩（photon avalanche PA）。

上转换纳米颗粒的合成要求反应物前驱体均一分散，对掺杂比例的优化、稀土元素氧化态的控制是制备过程中的要点[5]。激光蚀刻法和消解法可以从块体材料得到相应的纳米颗粒，但是很难实现对粒径和分散性的掌控。相对于上述物理法，化学法是更好的合成路径：如共沉淀法，溶胶-凝胶法，热分解法等法，水热合成法等。

共沉淀法：合成条件温和，设备易得，易于操作，是合成上转换材料最简便的方法。合成的上转换纳米颗粒粒径分布均匀且粒径可控。Yi等[6]首先提出了在EDTA辅助共沉淀法合成NaYF4：Yb，Er，方法为将稀土离子-EDTA复合物迅速加入到NaF溶液中并剧烈搅拌。通过均相成核过程生成了α相的NaYF4：Yb，Er纳米颗粒，通过改变EDTA和稀土元素的比例可将粒径控制在37 nm～166 nm。由于α相的纳米颗粒上转换发射太弱，需要通过煅烧印发相转换为β相，上转换荧光可增强40倍左右。共沉淀法的缺点是产物结晶程度低，煅烧后的材料容易团聚水溶性差。

溶胶-凝胶法：溶胶凝胶法是制备溶液前驱体，经过溶胶进而转变为凝胶，而后经焙烧热处理取出有机成分，这种方法制难以控制纳米颗粒的形状和粒径，所以难以达到单分散的纳米颗粒，而且产物经常会收到炭颗粒污染物。另外溶胶凝胶法还能用于合成氧化和氢氧化纳米材料[7]。经过改进的溶胶凝胶法可通过使用金属醋酸盐三氟乙酸制备掺杂Eu3+离子的CaF2纳米颗粒，首先将Ca（OH）2和Eu（CH3COO）3·4H2O溶解于去离子水和乙醇混合物中，用三氟乙酸超声1 h，得到的沉淀在100℃干燥24 h并高温陈化，将温度升高至700℃调整实现使粒径从15nm～200nm的增加[8]。

热分解法：原理基于金属四氟醋酸盐可热分解形成相应的金属氟化物。特征的热分解反应步骤为将溶剂和金属四氟醋酸盐在三颈瓶中，剧烈搅拌后加热至100℃除去水和氧气得到透明溶液，继续在氩气的环境中加热到250℃～330℃。将过量的乙醇导入溶液中，沉淀物经过离心与液相分离，洗涤后烘干即可得到目标产物[9-11]。近些年来溶胶凝胶法经过不断完善，改变反应物类型、比例，使用新型溶剂[12]和优化加热程序[13]，可得到满意的上转换纳米材料。尽管热分解法被证实为一种有效的合成单分散，结晶度高粒径均一和纯净的上转换纳米颗粒，但是仍有一些不足，诸如合成是条件苛刻，时间长温度高，过程中会产生有毒物质等。

水热合成法：水热反应指的是在密闭的高温高压环境中进行的合成步骤，基于在高温高压下在水中的高溶解度，并可将使溶解在液相中的物质形成结晶，反应过程不需要毒性高的有机溶剂的使用，相对于热分解法更加绿色友好。典型的水热反应是在一种特制的反应容器—反应釜中进行。此方通过优化反应时间和配比可得到亲水性强发光效率高的优良上转换荧光材料，具有以下优势：（1）产物结晶度高（2）相对低的反应温度（3）操作过程使用设备简单。但由于水热法无法对合成的晶型粒径进行精确的控制，制备产物重现性较差。

溶剂热法：在水热法的基础上发展起来的，密闭体系中以有机物或非水溶媒为溶剂，在一定的温度和溶液的自生压力下，原始混合物进行反应的一种合成方法。它与水热反应的不同之处在于所使用的溶剂为有机物而不是水广。溶剂热法已泛用于合成多种纳米晶体，包括贵金属，磁颗粒，半导体，量子点（QD），金属骨架结构（MOFs）等。此方法基于“液体-固体-溶液”（LSS）相转移、相分离的反应模式，通过对不同界面处化学反应的控制，建立了一种单分散纳米晶的通用合成方法。这种多相溶剂热制备工艺最大的特点是特别适于生长具有规则取向、晶形完好、粒径均匀的高质量氟化物纳米晶，对产物形貌、尺寸和结构的控制相比传统的水热/溶剂热方法也更加容易。张勇[14]等对溶剂热法合成纳米材料进行了深入的研究，实现了对晶型发光性能等的精确调控。

2 表面修饰

一般方法合成的稀土离子掺杂上转换纳米材料表面经常带有疏水基团使得其水溶性差，或者缺乏合适的反应官能团来进行分子偶联，故表面修饰是上转换纳米材料进行实际应用前必不可少的处理过程。

包覆无机壳层：在大多数情况下通过硅烷化来包覆无机壳层，是合成的纳米颗粒表面包覆一层无定型二氧化硅。最常见的Stöber法用硅氧烷前驱物如四乙氧基甲硅烷，在乙醇和氨水的存在下发生水解和沉淀，修饰后溶解度大大增加，并易于进行偶联抗体等实现不同功能化。

修饰有机配体：包括表面修饰柠檬酸，配体交换法修饰羧基，利用Lemieux-von Rudloff（KMnO4+NaIO4水溶液）在纳米颗粒表面修饰羧酸，聚合物包裹法静电吸附聚合物等。需要根据合成材料的目标性质和应用来选择合适的有机配体。

偶联生物识别因子：将生物识别分子，如抗体，酶，DNA探针，适配子等于上转换材料进行偶联，能将上转换荧光信号与特异性识别性结合，极大的丰富了上转换材料的应用范围。修饰生物分子需要在反应同时保持生物分子的活性，操作的要求较高。

3 上转换纳米颗粒应用于生物传感器

3.1 检测生物分子

Zhang[15]等用水热法一锅合成了水溶性的PAA修饰的NaYF4：Yb，Er纳米颗粒基于荧光共振能量转移（FRET）对谷胱甘肽的检测，在合成的上转换纳米颗粒上连接多巴胺，多巴胺在碱性条件下被周围的氧气氧化成强吸电子的苯醌形态，上转换过程中的激发电子被多巴胺-苯醌捕获无法回落至基态，从而阻断了上转换的发光过程。当加入还原性很强的谷胱甘肽后，苯醌被还原成为很好的电子供体从而使NaYF4：Yb，Er颗粒的上转换荧光恢复，荧光恢复量于谷胱甘肽加入量呈很好的线性关系，检测限低特异性强，成功地应用于血清中谷胱甘肽的检测，如图1。

图1 PAA修饰的NaYF4：Yb，Er纳米颗粒用于对谷胱甘肽的检测Fig.1 The PAAmodified NaYF4：Yb，Er UCNPsused for the detection of GSH

He[16]等报道了一种上转换材料传感器用于ATP的检测，此方法合成NaYF4：Yb，Er纳米颗粒，包覆硅壳后修饰羧基。将ATP配饰子分成两段，一段与纳米颗粒表面的羧基偶联，另一段连接黑洞猝灭因子。优化比例将2种体系混合，当ATP目标物存在时将两段配饰子链接，黑洞猝灭子与上转换纳米颗粒的距离接近并发生荧光共振能量转移使上转换发光猝灭，而无ATP存在时两者距离远而无猝灭发生，如图2。

图2 基于荧光共振能量转移的夹心型NaYF4：Yb，Er传感器对ATP的检测Fig.2 TheUCNPs-sandwich FRET sensor used for thedetection of ATP

此方法对ATP的检测限达到1.70μM并且显示高特异性灵敏性。

相似的Li的课题组报道了一种基于荧光共振能量转移的上转换材料传感器检测葡萄糖如图3[17]，将刀豆蛋白A结合在上转换纳米颗粒NaYF4：Yb，Er表面，表面包覆β环糊精的金纳米颗粒可以和刀豆蛋白A结合，从而使上转换发射被金纳米颗粒猝灭。而当葡萄糖存在时会竞争性地与刀豆蛋白A结合从而恢复上转换纳米颗粒的荧光，从而实现对葡萄糖的定量检测。

图3 基于荧光共振能量转移的上转换NaYF4：Yb，Er传感器检测葡萄糖Fig.3 TheUCNPs-FRET sensor used for the detection ofglucose

3.2 检测金属离子

汞离子是毒性最大的金属离子之一，会引起严重的环境问题，存在于环境食品中的汞离子通过食物链在人体中积累，并对中枢神经带来极大损伤。Liu[18]等报道了基于上转换纳米颗粒对汞离子检测并可很好地应用于生物体中。首先合成了钌络合物N719并装配于NaYF4：Yb3+，Er3+，Tm3+上转换纳米颗粒表面，其吸收峰与纳米颗粒的发射峰极好地重叠而使上转换信号猝灭，汞离子的存在可使N719的最大吸收峰显著蓝移，与上转换发射峰的重叠度降低，从而使上转换荧光恢复。（如图4）由此可高特异性快速地检测汞离子浓度，检测限低于美国EPA规定饮用水中汞离子的上限2 ppb，还可以应用于汞离子的细胞中的成像。

图4 NaYF4：Yb3+，Er3+，Tm3+上转换纳米颗对汞离子检测原理Fig.4 ThemechanisMof UCNPssensor for thedetection of Hg2+

Chen[19]等首次报道基于NaYF4：Er3+，Yb3+纳米棒检测血钾含量，生色感应剂ETH 5294的吸收峰与上转换材料的发射峰有很好的重叠，从而基于离子交换机理内部渗透作用可对血液中的钾离子进行实时检测，背景荧光和自吸效应被极大地消除，与ICPMS与IES检测结果能很好地吻合。Xie[20]等制备了NaYF4：Er，Yb上转换纳米棒薄膜，首次将生色感应剂ETH5418嵌套在疏水基体中用离子交换机制来检测pH和金属离子。生色感应剂ETH5418在质子化和去质子化两个状态的吸收峰与纳米棒的上转换发射峰均有很好的重叠，由此通过生色团在不同离子环境下的吸收峰位置变化而引起的上转换荧光恢复来进行信号传感。可以检测血液pH和Na+、K+、Ca2+、Cu2+等多种离子。

图5 生色感应剂ETH 5294的吸收峰和NaYF4：Er3+，Yb3+纳米棒的发射峰重叠Fig.5 Theabsorption peak of the chromophore ETH 5294 overlaps theeMission peak of the UCNPs

3.3 即时诊断

Qiu[21]等报道了一种基于上转换纳米颗粒的免疫层析测试盒。这种测试盒的包括层析测试条，特制的用于控制气囊的制动装置，UCP测量计。层析试纸条与传统的试纸条不同的是装备了储液槽储存洗脱用的缓冲溶液并和气囊以瓣膜连接，控制器向气囊施加压力使缓冲溶液进入层析试纸条将多余未偶联的物质除去。待测目标物为菌类扩增子，在测试前与预处理溶液混合，扩增子两段分别连上生物素和DIG半抗体。层析试纸条的测试线固定了亲和素，对比线固定羊抗鼠抗体。待测液通过层析试纸，目标物被吸附在测试线上，然后控制器将洗脱液压入试纸条将未吸附的物质洗出，最后控制器将包覆了鼠抗DIG抗体的上转换纳米颗粒溶液压入，在阳性测试中，测试线通过DIG半抗原，对比线通过羊抗鼠抗体都结合了上转换纳米颗粒。最后通过测试盒自带的光源激发上转换荧光，并通过测试线与对比线上转换荧光强度之比可即时得出强阳性，中阳性和阴性的检测结果。

基于上转换材料的侧流层析试纸条也有了广泛的研究，如实现了使用双抗体夹心法制备试纸对Y干扰素的检测[22]，使用抗体酶联免疫法制备试纸检测肺炎链球菌B表面抗体等[23]。Hong等[24]制备了一种十通道的横流层析试纸条，使用双抗原夹心法对鼠疫耶尔森抗体的检测，10个通道分别对应检测10种对应抗体的检测。上转换技术与免疫层析技术相结合制备的试纸条能极大地避免背景荧光的干扰，在即时检测诊断中实现了广泛应用。

图6 基于上转换材料的横流免疫层析试纸条Fig.6 Thelateral flow strip based on UCNPs

4 本实验室研究实例

使用溶剂热法合成上转换纳米颗粒，粒径为60 nm（图7），在有机相中的分散性良好，上转换荧光峰位于545 nm。用反相微乳液法包覆SiO2分子印迹壳层，并结合纳米金同时印迹，洗脱模板后获得液相传感器。制备出的传感器在双酚A浓度为50 ng/mL～500 ng/mL范围内有较好的响应，响应时间为1.5 h，如图7右，在100min荧光猝灭达到平衡。实验表明

图7 溶剂热法制备的上转换纳米颗粒分散于环己烷（左）传感器相应时间（右）Fig.7 The UCNPsprepared by solvothermalmethod disperse in cyclohexaneand the response tiMeof the sensor

其选择性好，灵敏度较高。通过洗脱再生可重复使用。此种传感器的制备方法通用性好，成本低，可推广至其他农残分子印迹纳米颗粒的制备，有望建立UPT-MIP的快速检测平台。

5 总结与展望

近些年来上转换材料在合成修饰和实际应用方面取得了突飞猛进的发展，仍然存在许多问题。另外上转换材料应用于传感器的构建在实验室研究方面已经取得了很大成功，但在应用于实际检测，实现传感器的商品化的方面仍亟待进一步发展。将上转换技术与酶联免疫技术，胶体金技术联合起来，实现对目标物的快速灵敏检测，在食品安全与卫生，医学检测等方面有重大的意义。

[1]Shen J,Sun L.-D,Yan C.-H.LuminescentRare Earth anomaterials for Bioprobe Applications[J].Dalton Trans,2008,14：5687-97

[2]Vetrone F,Capobianco JA.Lanthanide-Doped Fluoride Nanoparticles：Luminescence,Upconversion,and BiologicalApplications[J]. Int.J.Nanotechnol,2008,5：1306-1339

[3]DosevD,NichkovaM,Kennedy IM.Inorganic Lanthanide Nanophosphors in Biotechnology[J].JNanosci Nanotechnol,2008,8：1052-1067

[4]Auzel F.Upconversion and anti-Stokesprocesseswith fand d ionsin solids[J].Chem.Rev,2004,104：139-73

[5]Bouzigues C,Gacoin T,Alexandrou A.Biological Applications of Rare-EarthBased Nanoparticles[J].ACSNano,2011,5：8488-8505

[6]YiGS,Lu H C,Zhao SY,etal.Synthesis,characterization,and biological application of size-controlled nanocrystallineNaYF4：Yb,Er infrared-to-visible up-conversion phosphors[J].NanoLett,2004,4：2191-2196

[7]Fedorov PP,Luginina A A,Kuznetsov SV,et al.Nanofluorides[J]. J.Fluorine Chem,2011,132：1012-1039

[8]Hong B C.Kawano,Syntheses of CaF2：Eu nanoparticles and the modified reducingTCRA treatmenttodivalent[J].EuionK.Opt.Mater, 2008,30：952-956

[9]Yan ZG,Yan CH.Controlled synthesisof rare earth nanostructures [J].JMaterChem,2008,18：5046-5059

[10]Shen J,Sun LD,Yan CH.Luminescent rareearth nanomaterials for bioprobeapplications[J].Dalton Trans,2008：5687-5697

[11]FengW,Sun LD,Zhang YW,etal.Synthesisand assembly of rare earth nanostructures directed by the principle of coordination chemistry in solution-based process[J].Coord CheMRev,2010, 254：1038-1053

[12]Shan JN,Qin X,Yao N,et al.Synthesis ofmonodispersehexagonalNaYF4：Yb,Ln(Ln=Er,Hoand Tm)upconversionnanocrystals in TOPO[J].Nanotechnology,2007,18：445607

[13]WeiY,Lu FQ,Zhang X R,etal.Synthesisofoil-dispersiblehexagonal-phase and hexagonal-shaped NaYF4：Yb,Er nanoplates[J]. CheMMater,2006,18：5733-5737

[14]Zhengquan L,Yong Z.An efficient and user-friendlymethod forthe synthesis of hexagonal-phaseNaYF4：Yb,Er/TMnanocrystals withcontrollable shape and upconversionfluorescence[J].Nanotechnology,2008,19：345606

[15]Zhang Y,Tang Y R,Liu X,et al.A highly sensitive upconverting phosphors-based off-on probe for the detectionof glutathione[J]. SensorActua.B-Chem,2013,185：363-369

[16]He X X,Li Z X,Jia X K,et al.A highly selective sandwich-type FRETassay for ATPdetection based on silica coated photon upconverting nanoparticlesand splitaptamer[J].Talanta,2013,11：105-110

[17]Peng JH,Wang Y H,Wang JL,etal.A new biosensor for glucose determination in serumbased on up-convertingfluorescence resonance energy transfer[J].Biosens Bioelectron,2011,28：414-420

[18]Liu Q,Peng JJ,Sun LN,etal.High-Efficiency UpconversionLuminescentSensingand BioimagingofHg(II)by Chromophoric RutheniumComplex-Assembled Nanophosphors[J].ACSNano,2011,5：8040-8048

[19]Xie L X,Qin Y,Chen H Y.Direct Fluorescent Measurement of Blood PotassiuMwith PolymericOptical Sensors Based on Upconverting Nanomaterials[J].AnalChem,2013,85：2617-2622

[20]Xie L X,Qin Y,Chen H Y.Polymeric Optodes Based on UpconvertingNanorods for FluorescentMeasurementsof pH and Metal Ions in Blood Samples[J].AnalChem,2012,84：1969-1974

[21]Qiu X B,Liu CC,Mauk MG,etal.A portable analyzer for pouchactuated,immunoassay cassettes.Sensor[J].Actuat B Chem,2011, 160：1529-1535

[22]Corstjens PAM,Zuiderwijk M,Tanke H J.A user-friendly,highly sensitive assay to detect the IFN-γsecretion by T cells[J].Clin－Biochem,2008,41：440-444

[23]LiLP,Zhou L,Yu Y,etal.Developmentofup-converting phosphor technology-basedlateral-flowassay for rapidlyquantitativedetection ofhepatitis B surfaceantibody[J].DiagnMicr Infec Dis,2009,63：165-172

[24]HongW Y,Huang L H,Wang H R,et al.Development of an upconverting phosphortechnology-based 10-channel lateralflow assay for profiling antibodies against Yersinia pestis[J].JMicrobiolMeth, 2010,83：133-140

Upconverting Technology Use for the Construction of Biosensors

TIAN Jing-han，NINGBao-an，ZHANGNa，PENGYuan，BAIJia-lei，ZHAOYu-feng，GAOZhi-xian*
（Tianjin Key LaboratoryofRisk Assessmentand Control Technology for Environmentand Food Safety，Institute ofHealth and EnvironmentMedicine，Tianjin 300050，China）

Upconverting nanomaterial enables the transformation of excitation source to high energy infrared radiation through a nonlinear progcess.The upconverting materials have the advantage of excellent tissue penetration，good biocompatibility，low background signal，large stocks shift，sharp emission peak，and insignificantphotobleaching，and have achieved greatdevelopmentnowadays.Herewe elaborate the synthesis，surfacemodification，application of theUCNPsof theseyears.Wehavesynthesized theUCNPs in organic phase，and developed aBPA sensorbased onourgreenemissionnanoparticles.

upconverting luminescence；fluorescentnanoparticles；surfacemodification；biosensor；BPA

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.036

2014-09-15

国家科技支撑计划（2012BAK08B06）；国家自然科学基重点项目（81030052）

田静菡（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：上转换材料及生物传感器。

*通信作者：高志贤（1963—），男，研究员，博士生导师，军事医学科学院卫生学环境医学研究所。