环境硒形态测定中预处理与分析方法的研究进展

胡 婷，向昌国

（1.吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，湖南张家界427000；2.吉首大学生态旅游湖南省重点实验室，湖南 张家界427000）

硒(Se)是人体的必需微量营养元素之一，具有防癌抗癌、清除体内自由基、抗衰老等作用，缺硒会引起如贫血、冠心病、大骨节病、克山病、糖尿病等40余种疾病[1]。硒元素的性质和硫元素很相似，在环境中存在多种氧化形态，包括以有机化合物和无机化合物形态存在[2]。在天然水环境中存在可溶态的Se2-，硒元素态以胶状形式存在，亚硒酸主要以HSeO3-和SeO32-形式存在，硒酸盐主要以SeO42-形式存在，有机态的硒常以蛋白质形态存在于生物体中[3]。不同形态的硒存在显著的地球化学差异，影响着硒在地质环境中的迁移、循环、生物可利用性和毒性[4]。在环境中硒的功能作用和毒性与形态也密切相关，其中无机硒有较大的毒副作用，而有机硒的毒性小[1]。补硒工程的推进以及富硒产品的开发对硒形态分析的要求越来越高，形态分析比传统的总量分析复杂很多，因为大多数食品中硒含量比较低，而聚硒在前处理的过程中容易挥发和转化。为了克服这些难题，近些年来，科技工作者从新技术手段的引用(主要表现为分析仪器的联用技术)、前处理的改进等方面对食品中硒的形态分析做了大量工作，以实现对不同基质的食品进行准确、高效的定量和定性分析。本文综述了硒形态分析预处理方法及其主要的分析方法。

2 硒形态分析预处理方法

形态分析的预处理在硒形态分析中占着极其重要的地位，预处理提取率的高低直接影响实验测定结果的准确性。由于硒形态的不稳定性，样品的提取过程应尽量保持硒形态的原始特性不变，比仅仅检测硒元素复杂得多，也是植物硒形态分析准确性的关键。目前并没有固定的预处理方法，按其提取方式主要分以下四种：液相萃取（LPE）、微波辅助萃取（MAE），固相微萃取（SPME）以及液相微萃取（LPME）。

2.1 液相萃取

液相萃取实际使用中主要有沸水提取[5-6]、0.1mol HCl提取[7-9]、5mmol柠檬酸提取[10]、25mmol乙酸铵提取[11]、1︰1甲醇水（v︰v）提取[12]以及蛋白酶水解提取[13-15]及加压液体萃取法[16]（PLE）等。分析上述各种液相萃取方法发现，水提对无机硒和一般非结合态的蛋白硒较适宜；酸提（盐酸和柠檬酸）的提取率较高，但在提取过程中导致硒形态发生转变的情况比较严重；酶解提取应用较为广泛，常用的蛋白酶有蛋白酶K，蛋白酶XIV，胰蛋白酶，胃蛋白酶和链霉蛋白酶，但提取时间长，需要根据环境中不同样品对蛋白酶进行筛选。

液相萃取过程中按照使用辅助仪器的不同，分为萃取提取、振摇提取、超声提取、离心提取、微波提取等，其中超声微波结合酶提取法可以有效缩短提取时间[17]。加压液体萃取法在锡和砷形态分析上得到应用，但在硒形态分析上应用较少[11]。辅助仪器的使用能在一定程度上提高样品中硒的提取率，Maira[17]等研究发现在蛋白酶提取过程中加入超声辅助后提取率有一定的提高，但对0.1mol/LHCl缓冲液和25mmol/L乙酸铵溶液提取加入超声辅助提取后硒代胱氨酸（SeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet）的提取率反而降低[18]，因此超声微波结合酶提取法提取效果较好。

液相萃取是实验室常用的提取硒形态的方法之一，该方法操作简便、可控性强，但该法提取率不高，需要进一步改进和优化。

2.2 微波辅助萃取

MAE根据不同物质吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被提取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小、微波吸收能力相对差的萃取剂中，达到提取目的，该法适用于批量处理热不稳定性物质，具有溶剂消耗少、污染小、时间短、安全性强等优点。王阮云[19]等和Hsieh[20]等发现，MAE过程中硒的主要四种形态Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、SeMet、SeCys的回收率能达到95%～101%，提取效果较好。

2.3 固相微萃取

SPME过程是无溶剂的，将纤维头浸入样品溶液中或顶空气体中一段时间，同时搅拌溶液以加速两相间达到平衡的速度，待平衡后将纤维头取出插入气相色谱汽化室，热解吸涂层上吸附的物质。被萃取物在汽化室内解吸后，靠流动相将其导入色谱柱，完成提取、分离、浓缩的全过程。Campillo[21]等应用HS-SPME提取GC-AES检测分析得到DMSe和DMDSe的回收率高于88%。SPEM适用于挥发性或半挥发性有机化合物，优点在于可用于处理量极小的样品、耗费时间短、成本低、方便操作等，然而大部分的水溶态不适于直接用SPEM。

2.4 液相微萃取

LPME[22]发展于LPE之上，是将微量的有机萃取液插入样品或悬于样品之上，在溶剂用量上，可以看作是LPE的微型化，萃取与进样都只需一个极简单的装置—微量进样器，且萃取和浓缩一步完成，方便、简单、快速、污染少、便宜，且能达到与SPME相同的萃取效果。Saleha[23]等采用HF-LPME提取，应用高效液相色谱检测水质中Se（Ⅳ），该方法检出限低于3.7%。

3 硒形态分析

目前对于硒的测定方法有许多种，既包括常用的荧光分光光度法、分光光度法、原子荧光法、原子吸收光谱法和种子活化法，也有简单实验条件下的重量法、滴定法、比色法、伏安法，还包括高精度实验条件下的催化极谱法、气液色谱法、ICP-AES法、ICP-MS法和中子活化法(NAA)[24]。基于环境样品中硒形态复杂的特点，需要对其进行高精度的分离，实验过程中常采用联用技术进行分析[25]。硒形态分析联用技术主要分为三个部分，分别为分离、检测和鉴定。完成预处理的样品通过各种分离柱使形态在通过柱子的过程中发生分离，再通过联用装置中的检测器对各形态进行检测。

3.1 硒形态分析分离联用

在联用装置中处于分离角色的主要有高效液相色谱法（HPLC）、体积排阻法（SEC）、反相或离子对反相法（RP/IP-RP）、离子交换法（IE）等。

HPLC是一种具有高效的分离技术，尤其适用于热稳定性差、分子量大、极性较强的物质的分离，是目前常用的分离手段。Sandra[26]等应用体积排阻色谱柱分析芥菜和向日葵中有机硒形态，并分离出样品中硒蛋白的主要成分硒代蛋氨酸；Emese[27]等采用离子交换法成功地从胡萝卜中分离出硒代蛋氨酸；Emese[28]等采用反相离子对色谱法从北葱样品中分离出Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet、SeCys四种主要形态。

3.2 硒形态分析检测联用

环境中硒形态的检测主要有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子吸收光谱（AAS）、原子荧光光谱（AFS）、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）、中子活化分析（INAA）等。大部分报道分析硒形态主要是Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet、SeCys四种形式[40]，通常采用ICP-MS进行检测，该法有灵敏度高、高选择性等优点，并且可与高效液相色谱（HPLC），毛细管电泳（CE）耦合形成HPLC-ICP-MS，CE-ICP-MS分析系统成为目前硒形态分析应用较为广泛的方法[10,12,26-28]。HPLC与具有极低的检测限、较宽的动态线性范围、干扰少、分析精密度高、速度快和可测定多元素等优点的ICP-MS联用，能够较精确地检测出生物环境中的多种形态[29]。仲娜[9]建立了HPLC-ICP-MS分析方法，该法分离情况、出峰情况均较好，相对标准偏差为0.5%。Stephane[39]采用HPLCUV-HG-AFS检测出四种形态的检出限分别为Se(Ⅳ)19 pg、Se(Ⅵ)36 pg、SeMet28 pg、SeCys60 pg，该法的重复性能够达到与ICP-MS相同的效果。张涛[25]通过建立SEC-UV-ICP-HPLC方法分析富硒大米提取液清蛋白中硒形态，通过比较280 nm紫外光下的蛋白图谱和ICP-MS测定的80Se得到的质谱图分析富硒大米清蛋白中含硒蛋白组份的分布。

Capelo[30]等详细描述了AAS和AFS作为元素检测方法在硒形态分析中的应用，指出AAS和AFS能够代替ICP-MS成为测量结果可靠、仪器运行成本低、可与色谱分离方法联用的检测手段。Moreno[31]等使用PV-GCAFS法对富硒大蒜中的可挥发性硒化合物进行分析；Tsopelas[32]等利用LC-ICP-AES法分析了6种硒化合物的标准物。也有人采用其他方法测定硒的含量，如中子活化法等。Killa[33]等将反相液相色谱与双电极化学检测结合使用。谢能泳[34]等对SeO3、SeO4在离子色谱上的行为进行了研究。吴迪[36]采用流动氢化物发生电感耦合等离子体-原子发射光谱（HG-ICP-AES）测定了温莪术中硒元素的含量。程庆龙[37]分别用ICP-AES法测定蜂蜜中硒元素的含量，并与AAS法进行了比较，发现用2种方法测定蜂蜜中硒元素的含量值接近，无显著性差异，但ICP-AES法较AAS法具有简单、灵敏度高、准确性好等优点。由此可见，硒的形态分析将随着各种选择性好、灵敏度高的分离检测技术的应用而不断取得新的进展[35]。

3.3 硒形态分析鉴定联用

硒形态鉴定方法主要是基质辅助激光解附电离（MALDI-MS）和电喷雾电离质谱（INAA）。MALDI是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。ESI-MS也是一种软的电离方式，在一定的电压下它不会使样品分子产生碎片，因此对于小分子的样品ESI谱图可确定样品的组成成分有几种。但对于大分子的蛋白质来说，由于要形成非常复杂的多电荷峰，因此，分析大分子混合物较为困难，一般只用于分析较纯的大分子化合物。Larsen[38]等利用IE-HPLC-ESIMS在海藻的三氯乙酸提取液中鉴定出二甲基硒丙酸(DMSeP)的存在，从而推测从二甲基硒丙酸到二甲基硒的转变可能是硒生物地球化学循环过程中一条重要的代谢途径。

4 结语

硒的功能活性和作用机理与摄入硒的化学形态密切相关。形态分析前的预处理占有极其重要的地位，目前尚未有固定的预处理方法，从本文分析的多种预处理方法来看，其中液相萃取是目前使用最为广泛的提取方法，该法使用条件限制性较小，其中蛋白质酶解提取是目前实验室硒形态分析首选的预处理方法之一；微波辅助萃取能够进一步提高提取率，但是应用并不广泛；固相萃取更加适用于挥发性和半挥发性硒形态的提取；液相微萃取快速、方便，由于该装置价格较高，目前并未得到广泛使用。近年来，应用于硒及硒化学形态研究的技术越来越多，己在环境样品、食物样品中硒化合物及元素的形态和价态分析得到应用，但由于植物体中基质复杂，硒化合物的浓度偏低，并且许多待分析的含硒化合物无相应标准物可供参考，所以，目前为止还没有一种植物体内的硒化合物被完全分析清楚。硒形态测定常用的四种方法各有优缺点。形态分析中常采用联用技术，其中HPLC-ICP-MS是目前国外应用最为广泛的分析方法之一，该方法操作简单、方便经济，但灵敏度和精确度差；而准确度高、灵敏度好的，又由于设备价格不菲，国内尚未普及。但HPLC-ICP-MS方法是微量元素形态分析的趋势。故在选择硒形态方法时应既要考虑测定所要求的灵敏度、精确度、干扰因素，又要注意方法本身所需要的投入，包括仪器、材料、药品和时间等。综合考虑各方面因素，选择一种适于目标要求的准确、有效、简便的方法。

相信随着现代分析检测技术的进一步发展，环境样品中含硒化合物的提取、纯化、分离、检测和鉴定方法都将会得到更进一步的改进和提高，更多分析方法和新型技术将会应用到硒形态的测定中，为广大工作者提供更为快速、准确、高效和适用性广的分析方法。

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