五子衍宗丸对 ATRA诱导的神经管畸形防治作用初探

樊慧杰， 柴 智， 解 军， 王永辉， 周 然*

（1.山西中医学院， 山西 太原 030024； 2.山西医科大学， 山西 太原 030001）

五子衍宗丸对 ATRA诱导的神经管畸形防治作用初探

樊慧杰1， 柴 智1， 解 军2， 王永辉1， 周 然1*

（1.山西中医学院， 山西 太原 030024； 2.山西医科大学， 山西 太原 030001）

目的 初步研究五子衍 宗 丸 对 全 反 式 维 甲 酸 （ all-trans-retinoic acid， ATRA） 诱 导 的 神经管畸形 （ neural tube defects， NTDs） 的防治作用， 并筛选出五子衍宗丸防治 NTDs的最佳给药方式。 方法 BALB/c雄鼠和雌鼠以 1 ∶2 比例合笼， 有阴栓者为孕鼠。 将 110 只孕鼠随机分为正常组、 模型组、 五子衍宗丸先给组、 五子衍宗丸和 ATRA同时干预组、 五子衍宗丸后给组， 后 3 组又各分为五子衍宗丸高 （4.20 g/kg）、 中 （2.10 g/kg）、 低 （1.05 g/kg） 剂量 3 个亚组。 孕11 d时处死各组孕鼠， 解剖取出子宫， 显微镜下分离胚胎， 光镜鉴定神经管畸形， 计算发生率。 结果 与正常组比较， 除五子衍宗丸高剂量先给组的差异无统计学意义 （P ＞0.05）， 其余各组均有统计学差异 （P＜0.05）。与模型组比较， 五子衍宗丸中、 高剂量先给组， 五子衍宗丸中、 高剂量和 ATRA同时干预组神经管畸形发生率显著降低， 差异均有统计学意义 （P＜0.05）； 但是五子衍宗丸中、 高剂量后给组和五子衍宗丸低剂量各组神经管畸形发生率的差异无统计学意义 （P＞0.05）。 分别与五子衍宗丸中、 高剂量和 ATRA同时干预组比较， 五子衍宗丸中、 高剂量先给组神经管畸形发生率的差异无统计学意义 （P＞0.05）。 分别与五子衍宗丸中剂量先给、 同时给予组比较， 五子衍宗丸高剂量先给、 同时给予组神经管畸形发生率的差异无统计学意义 （P＞0.05）。 结论 五子衍宗丸对 ATRA诱导的神经管畸形有防治作用； 本实验中 4.20 g/kg五子衍宗丸预先给药是防治神经管畸形的最佳给药方式。

五子衍宗丸；神经管畸形；肾主生殖

神经管畸形是一种影响脑和脊髓的先天性新生儿出生缺陷［1］， 表现为无脑畸形、 脑积水和脊柱裂等［2］。 我国北方是神经管畸形的高危地区， 发病率为 5.57 ‰， 是世界平均发病率的 10 倍［3-5］。 神经管畸形 病因复 杂， 环境因素和遗传因素均可引发神经管畸形。目前只通过口服叶酸未能完全阻断神经管畸形的发生。来源于父母的先天之精构成胚胎， 若 “肾精不足” 则可致先天性发育异常。 五子衍宗丸为 《摄生众妙方》 中的补肾方剂， 方中各药共发挥补肾益精之效。 本研究给孕鼠灌胃全反式维甲酸 （ATRA） 建立小鼠神经管畸形模型，分别在模型建立前、同时、后给予补肾方剂五子衍宗丸对孕鼠进行干预，观察五子衍宗丸对神经管畸形的防治作用，筛选出五子衍宗丸防治神经管畸形的最佳剂量和最佳给药时间。

1 材料

1.1 动物 健康成年 BALB/c小鼠， 雌雄比例为 2 ∶1， 体质量 （23 ±2） g， 由北京华阜康生物科技股份有限公司提供， 动物合格证号 SCXK （京） 2009-0004。 饲养环境通风良好， 自由摄取水食， 按昼夜节律自然照明、 室温 （22 ± 2） ℃、 湿度 45% ～55%。

1.2 药物和试剂 五子衍宗丸 （由枸杞子、 菟丝子、 覆盆子、五味子、车前子组成）由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产 （批号 2035248）， 用蒸馏水将成药配制为混悬液， 给予小鼠灌胃的高、 中、 低剂量分别是 4.20、2.10、 1.05 g/kg（剂量按体表面积折算， 分别相当于成人临床推荐日用量的 2 倍、 1 倍、 0.5 倍）。 ATRA购于美国Sigma公司。

1.3 仪器 BS224S 型万分之一电子天平 （德国赛多利斯集团）； KQ-300VDE超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）； SMZ-168 体视显微镜 （麦克奥迪实业集团有限公司）。

2 方法

2.1 建立神经管畸形胎鼠模型 BALB/c雄鼠和雌鼠 1 ∶2比例于中午12时合笼， 次日早上8时分笼并检查阴栓， 有阴栓者为孕鼠。 将发现阴栓的当天中午 12 时定为胚胎（embryo， E） 0.5 d。 用香油溶解 ATRA粉末， 按 50 mg/kg剂量灌胃干预 E7d 孕鼠， 正常组灌服等体积的香油。 课题组前期研究发现， 用 ATRA对 E7d 孕鼠进行干预， 胎鼠于E9.5d 开始出现神经管畸形， 且神经管畸形发生进程一直到 E11.5d （神经管发育完成） 结束， 所以本实验 选取E11d 胎鼠进行研究。 解剖 E11d 孕鼠取出胎鼠， 参照正常组，光镜下观察胎鼠神经管的形态，鉴定神经管畸形的发生［6］。

2.2 分组及给药

2.2.1 分组 ①正常组、 ②模型组、 ③五子衍宗丸先给组、 ④五子衍宗丸和 ATRA同时干预组、 ⑤五子衍宗丸后给组。③、④、⑤组又分别按照五子衍宗丸高、中、低剂量的不同分为3个亚组。 每组10只孕鼠， 以其胎鼠为研究对象。

2.2.2 给药 模型组孕鼠分别在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃给予蒸馏水， 每天 1 次， 连续 3 d， E7d 一次性灌胃给予孕鼠ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 灌胃给予蒸馏水， 每天 1 次，连续3 d。 五子衍宗丸先给组的3个亚组按五子衍宗丸高、中、 低剂量在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃给予孕鼠， 每天 1 次，连续 3 d， E7d 一次性灌胃给予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、E10d 灌胃给予蒸馏水， 每天 1 次， 连续 3 d。 五子衍宗丸和 ATRA同时干预组的 3 个亚组在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃给予蒸馏水， 每天1次， 连续3 d， 按五子衍宗丸高、 中、 低剂量在 E7d 一次性灌胃给予孕鼠， 同时灌胃给予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 灌胃给予蒸馏水， 每天 1 次， 连续 3 d。 五子衍宗丸后给组的 3 个亚组在 E4d、 E5d、 E6d灌胃给予蒸馏水， 每天 1 次， 连续 3d， 在 E7d 一次性灌胃给予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 按五子衍宗丸高、中、 低剂量灌胃给予孕鼠， 每天1次， 连续3 d。 正常对照组孕鼠在 E4d ～E10d 时间段， 除 E7d 给予等体积香油外，其余时间给予等体积的蒸馏水，每天1次。灌胃体积均为20 mL/kg， 称重并根据体质量调整给药量。

2.3 样品制备及指标检测 E11d 时颈椎脱臼法处死各组孕鼠，仰卧固定四肢于手术台上。于腹中线剪开皮肤和肌肉，暴露腹腔，可见子宫，剪断子宫系膜，将成串子宫取出， 用 PBS 清洗后， 移入盛有 PBS 的玻璃培养皿中， 解剖显微镜下小心剥离胎盘和胎膜组织，取出胚胎，光镜下鉴定神经管畸形的发生情况，用神经管畸形发生率 （每只孕鼠神 经 管 畸 形 胎 鼠 数/每 只 孕 鼠 总 胎 鼠 数 ×100%）表示［6］。

2.4 统计学处理 采用 SPSS 17.0 统计软件分析数据， 所得结果 用表 示。 应 用 单 因 素 方 差 分 析 （ one-way ANOVA） 比较各组间均数。 P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 神经管畸形胎鼠模型的形态学鉴定 正常组孕鼠的胚胎数为7 ～15 个， 母鼠子宫无充血， 吸收胎少见， 解剖显微镜下可见多为活胎、偶有死胎、无畸形胎，活胎外形完整圆润饱满、脑泡闭合完全、脊柱表面无可见裂口、神经管正常闭合。模型组孕鼠子宫有充血瘀血现象，吸收胎多见，解剖显微镜下可见活胎发育迟缓、死胎增多、有神经管畸形胎，神经管畸形胎外观瘦小、形态崎岖各异、不完整，可见无脑、脊柱裂、甚有整个神经管未闭合的现象。造神经管畸形胎鼠模型成功。

3.2 五子衍宗丸对胎鼠神经管畸形的干预结果 与正常组比较，除五子衍宗丸高剂量先给组的差异无统计学意义（P＞0.05）， 其余各组差异均有统计学意义 （P＜0.05）。与模型组比较，五子衍宗丸中、高剂量先给组，五子衍宗丸中、 高剂量和 ATRA同时干预组胎鼠神经管畸形发生率明显降低， 差异均有统计学意义 （P＜0.05）； 但是五子衍宗丸中、高剂量后给组和五子衍宗丸低剂量组 （先给、同时、 后给） 神经管畸形发生率的差异无统计学意义 （P＞0.05）。 将对神经管畸形有防治作用的 4 组进行剂量之间、给药时间之间的比较；分别与五子衍宗丸中、高剂量和ATRA同时干预组比较， 五子衍宗丸中、 高剂量先给组胎鼠神经管畸形的发生率有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 分别与五子衍宗丸中剂量先给、 同时给予组比较，五子衍宗丸高剂量先给、同时给予组胎鼠神经管畸形的发生率有降低趋势，但差异无统计学意义 （P＞0.05）。 见表 1。

表1 五子衍宗丸对胎鼠神经管畸形发生率的影响 （，n=10）

表1 五子衍宗丸对胎鼠神经管畸形发生率的影响 （，n=10）

注： 与模型组比较，*P＜0.05； 与正常组比较，▲P＜0.05

组别 剂量/（ g·kg-1）神经管畸形发生率/%正常组-0模型组 - 54.00 ±15.06▲五子衍宗丸高剂量先给组 4.20 9.00 ±3.16*五子衍宗丸中剂量先给组 2.10 19.00 ±7.38*▲五子衍宗丸低剂量先给组 1.05 47.00 ±12.52▲五子衍宗丸高剂量和 ATRA同时干预组4.20 16.00 ±6.99*▲五子衍宗丸中剂量和 ATRA同时干预组2.10 24.00 ±7.01*▲五子衍宗丸低剂量和 ATRA同时干预组1.05 52.00 ±14.76▲五子衍宗丸高剂量后给组 4.20 44.00 ±9.66▲五子衍宗丸中剂量后给组 2.10 51.00 ±11.97▲五子衍宗丸低剂量后给组 1.05 52.00 ±13.17▲

4 讨论

精包括 “先天之精” 和 “后天之精”［7］。 《医宗金鉴·卷二十六·删补名医方论卷一》云： “先身而生， 谓之先天”， 以及张锡纯所言 “以未生为先天， 已生为后天者”，则 “出生” 是 “ 先天” 和 “后天” 的分界线［8］。 子代先天之精受于父母生殖之精，是构成胚胎的原始物质；后天之精则是由自己脏腑所化生，是水谷之精微。有学者提出，“先天之精” 指的是遗传信息的内容和遗传信息读取全过程即中心法则，而遗传信息的化学存在方式和遗传信息读取过程的化学存在方式是肾脏的 “后天之精”； “先天之精” 和 “后天之精” 的关系是过程和实体、 信息和物质的关系［9］。 显然 “ 先 天之精” 是 决定人 生 长 发 育 的 基 础。《灵枢·经脉》曰： “人始生， 先成精， 精成而脑髓生……”，说明先天禀受的父母之精化生脑髓。若先天禀赋不足，髓海失充，元神失养，可导致大脑先天发育异常。神经管畸形是先天性发育异常的疾病，脑积水、学习障碍、腿部瘫痪、大小便失禁等临床表现与中医所言 “肾精不足”内涵密切相关。所以，神经管畸形属于中医先天禀赋不足之范畴，肾精亏损为其主要原因。五子衍宗丸中菟丝子温肾益精，枸杞子滋肾填精，两药相合阴阳并补，共为君药；五味子益气补虚强阴涩精，覆盆子温肾而不燥固精而不凝，共为臣药；车前子涩中兼通，补而不滞，用为佐药［10］。 全方共奏补肾益精之功， 理论上恰可对证神经管畸形胎儿的先天禀赋不足之源。

本实验用五子衍宗丸对孕鼠进行不同时期的干预，在E11d 时解剖孕鼠鉴定神经管畸形的发生情况。 实验发现，对神经管畸形有防治作用的4组分别是五子衍宗丸高剂量先给组、五子衍宗丸中剂量先给组、五子衍宗丸高剂量和ATRA同时干预组、 五子衍宗丸中剂量和 ATRA同时干预组；低剂量组和五子衍宗丸后给组均无防治作用；结合各干预组与正常组的比较结果， 显示出高剂量4.20 g/kg的五子衍宗丸预先给药是防治神经管畸形的最佳给药方式。本实验为后续的五子衍宗丸干预神经管畸形的机制研究奠定了基础，同时为临床防治神经管畸形提供了一种新的思路。

［ 1 ］ Kumar A.Neural tube defects： a neglected problem［ J］. Indian Pediatrics， 2009， 46（8） ： 665-667.

［ 2 ］ Shaw GM， Carmichael SL， Vollset SE， etal.Mid-pregnancy cotinine and risks of orofacial clefts and neural tube defects［ J］. JPediatr， 2009 ， 154 （1 ）： 17-19.

［ 3 ］ Wang JF， Liu X， Christakos G， et al.Assessing local determinants of neural tube defects in the heshun region， Shanxi province， China［ J］.BMC Public Health， 2010， 10 （1 ）： 52-63.

［4］ 裴丽君，李 竹，李 松，等.中国神经管畸形高低发地区季节性及性别分布特征［J］.中华流行病学杂志， 2003，24（6）： 465-470.

［ 5 ］ Gu X， Lin L， Zheng X， et al.High prevalence of NTDs in Shanxi province： a combined Epidemiological approach ［ J］. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol， 2007， 79（10）： 702-707.

［ 6 ］ Shang Y， Zhao H， Niu B， etal.Correlation of polymorphism of MTHFRs and RFC-1 genes with neural tube defects in China［ J］ .Birth DefectsRes AClin Mol Teratol， 2008， 82（1） ： 3-7.

［ 7 ］ 朱抗美.肾的精气阴阳理论源流考［J］ .浙江中医学院学报， 1999， 10（5）： 12-13.

［ 8 ］ 孙 洁， 李秋芬， 周安方. “肾为先天之本” 考辨［J］ .中国中医基础医学杂志， 2006， 12（7）： 506-507.

［9］ 李 妍，侯丽辉，吴效科.中医肾主生殖理论探讨及现代研究进展［J］ .世界中西医结合杂志， 2008， 3 （9）：557-559.

［10］ 王秋萍， 王桐生， 龙子江， 等.五子衍宗丸对少弱精症模型大鼠精子质量及睾丸组织的影响［ J］ .中成药， 2011，33（10）： 1796-1797.

R285.5

： B

： 1001-1528（2014）05-1054-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.038

2013-07-18

国家自然科学基金项目 （81102552）

樊慧杰 （1978—）， 女， 博士， 讲师， 研究方向： 中药分子生物学。 Tel： （0351） 2272378， E-mail： fanhuijie.happy@163.com

*通信作者： 周 然 （1958—） ， 男， 博士， 教授， 博士生导师， 研究方向： 方剂效用及其物质基础。 Tel： （0351 ） 2272390， E-mail：zhour58@sohu.com

日期： 2013-09-04

网络出版地址： http： //www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20130904.1321.001.htm l