芩白清肺浓缩丸对肺炎支原体作用

蒙艳丽， 王 欣， 王伟明

（黑龙江省中医研究院中药所， 黑龙江 哈尔滨 150036）

芩白清肺浓缩丸对肺炎支原体作用

蒙艳丽， 王 欣， 王伟明*

（黑龙江省中医研究院中药所， 黑龙江 哈尔滨 150036）

目的 观察芩百清肺浓缩丸 （黄芩、 百部、 桔梗、 地龙、 麦冬、 紫菀 ） 对肺炎支原体 ATCC 15531 的作用。 方法 肺炎支原体给予低剂量 和高剂 量的芩百清 肺浓缩丸后， 利 用 Real-time PCR、 Reverse Transcription-PCR、 Western Blot方法测定肺炎支原体黏附蛋白 P1、 P30 的表达。 结果 与空白组比较， 芩百清肺浓缩丸高剂量组和低剂量组都能下调 P1、 P30 mRNA和 P1 蛋白表达， 但高剂量组作用更加显著。 结论 芩百清肺浓缩丸通过降低 P1、 P30 肺炎支原体蛋白的表达，从而妨碍肺炎支原体在呼吁道上皮细胞的定植达到抗肺炎的作用。

肺炎支原体； 芩百清肺浓缩丸； P1； P30

肺炎支原体是各年龄特别学龄前儿童呼吸道感染最常见病原体，因小儿的肺结构发育不完善，经过反复感染后，易致纤维化等肺部疾病［1］。目前临床药物普遍存在毒副作用及易引起耐药等缺点。芩百清肺浓缩丸是国家食品药品监督管理局批准的第一个用于临床治疗小儿支原体肺炎的中药新药。其中黄芩为君药，百部为臣药，佐以桔梗、地龙、麦冬、紫菀，共六味药组方而成，具有清肺之热毒、苦寒降肺之逆气，保肺之阴津、苦润复金之清肃，共奏清热解毒，润肺止咳之功效，尚无毒副作用，也不引起耐药。前期试验表明其治疗肺炎支原体及其耐药株作用确切［2］， 能提高免疫功能和促进气道组织修复［3-4］。

本研究首先利用 BALB/c小鼠肺组织病理阐明芩百清肺浓缩丸有抗肺炎支原体作用，再通过肺炎支原体实验株研究肺炎支原体黏附蛋白 P1、 P30 表达，阐明芩百清肺浓缩丸抗肺炎支原体作用机制，确定药物作用的靶点，为新药开发提供理论依据。

1 材料

1.1 药品 芩百清肺浓缩丸， 自制， 本品为棕色薄膜包衣浓缩水丸，符合 2010 版 《中国药典》丸剂下的各项规定。

1.2 肺炎支原 体 培 养 肺 炎 支 原体 （ ATCC 15531 ） 购 自 American Type Culture Collection， 培养在胎牛血清中 24 h 后， 放于含 20%胎牛血清，10%酵母的 PPLO培养基中生长， 每隔 7 d 传代一次。实验分为肺炎支原体空白对照组和给药组，给药组分别在肺炎支原体培养基中加入 100 μg/m L芩百浓缩丸 （低剂量）和 200 μg/mL芩百浓缩丸（高剂量） 3 d， 提取 mRNA和蛋白质。

1.3 动物 BALB/c小鼠购自哈尔滨肿瘤医院实验动物中心， 饲养在 GLP环境。 小鼠被分成空白对照组， 模型对照组和给药组， 每组 10 只。 模型对照组和给药组小鼠乙醚麻醉后鼻滴入 20 μL 106CCu 肺炎支原体， 每天1 次， 共 3 d。 给药组分别给予芩百清肺浓缩丸 2.3 g/（kg·d） （低剂量） 和4.6 g/（kg·d） （高剂量） 6 d，空白对照组和模型对照组给予相同剂量的生理盐水。小鼠肺组织病理切片对比给药组与其它组肺结构的变化。

1.4 试剂 Trizol购自美国 Invitrogen 公司， 肺炎支原体检测试剂盒购自中国 Da An gene，one-step RT-PCR kit购自中 国 Tiangen， Goat anti-P1 购自美国 Santa， 引 物 均 合 成 自 上 海 生 物工程技 术 有 限公司。

1.5 仪 器 中 国 博 日 Real-Time PCR， Reverse transcribe PCR仪， Bio-rad 半干电转仪， Bio-rad 电泳仪和凝胶成像仪， 日本 Olympus荧光显微镜.

2 方法

2.1 HE染色 刚取的新鲜肺组织块经福尔马林溶液固定48 h，用镊子取出放到大的蜡盒上， 用刀片切成 1 cm×0.5 cm的小块， 用小白蜡盒包上，放入80%的乙醇中过夜。 第 2 天把蜡盒依次放入95%乙醇Ⅰ中 （3 h） -95%乙醇Ⅱ中 （3 h） -100%乙醇Ⅰ中 （3 h） -100%乙醇Ⅱ中 （过夜）。第2 天从100%Ⅱ的乙醇中取出小蜡盒放到 二甲苯Ⅰ、 二甲苯Ⅱ中各 30 min， 然后放入蜡缸Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ中各浸泡 30 min， 包埋， 切片， HE染色。

2.2 芩百清肺浓缩丸最小抑菌浓度 最小抑菌浓度是能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度，在这个浓度肺炎支原体代谢被抑制，培养基没有颜色改变。 800 μg芩百清肺浓缩丸加入 1 mL肺炎支原体的培养基中，使用二倍稀释法设定8个药物浓度（800 ～6.25 μg）， 当空白对照组即肺炎支原体培养基由红变黄时，8个给药组中培养基不变色组即最小抑菌浓度。 肺炎支原体在 100 ℃ 沸水中煮 10 min， 提取 DNA， 使用 Real-Time PCR， 按照 试剂盒步骤操作，测定各组中含支原体的量。

2.3 Reverse transcribe PCR 实验分为空白 对照组， 低剂量 组 （100 μg/mL） 和高 剂量组 （200 μg/mL）， 给药组加芩百清肺浓缩丸3 d， 收集肺炎支原体， 使用 Trizol提取 RNA， 按照一步法反转录PCR试剂盒实验过程扩增并检测 P1、 P30 mRNA水 平。 P1-forword primers 5′-CCTTGTGAATTTGCTCAG-3′， reverse primers 5′-GTCAGCTGCAGTTAGAAA-3′。 P30-forward primers 5′-ATGAAGTTACCACCTCGAAGAAGC-3′ ， reverse primers 5′-TTAGCGTTTTGGTGGAAAACCGGGTTG-3′。

2.4 WesternBlot 实 验分为空白 对 照 组， 低 剂量组 （100 μg/m L） 和高剂量组 （200 μg/m L），给药组加芩百清肺浓缩丸 3 d， 收集肺炎支原体， lysis buffer提 取 蛋白，检测蛋白浓度，相同蛋白浓度加入12%SDS-PAGE电泳，转 PVDF膜， 用羊抗 P1抗体 4 ℃孵化整夜， 兔抗羊抗体室温孵化 90 m in， 使用显影液显影， 分析条带，检测蛋白变化。

3 结果

3.1 肺组织的病理改变 肺组织 HE染色后， 显微镜拍照观察肺组织的病理改变 （图 1）。 在模型对照组中出现支气管上皮脱落，支气管血管周围间质增厚，肺泡塌陷，肺泡壁充血，毛细血管内有许多红细胞。低剂量组仅有部分支气管上皮脱落。高剂量组和空白对照组的肺组织相似 （HE染色 ×20）。

图 1 BALB/c小鼠的肺病理检测Fig.1 Pathological exam ination of the lungs of BALB/c m ice

3.2 芩百浓缩丸抗肺炎支原体药效实验［5］芩百浓缩丸药效实验结果显示芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体有明显抑制作用， 最小抑菌质量浓度达到 100 μg/mL（图2）， 具有临床治疗价值。

图2 芩百清肺浓缩丸抗肺炎支原体药效活性实验Fig.2 In vitro activity of QinbaiQ ingfei Pellets against Mycoplasma pneumonia

3.3 芩百清肺浓缩丸对 P1 基因和蛋白的影响 各组肺炎支原体提取 P1 蛋白和 mRNA， 使用 WesternBlot和 Reverse transcribe PCR方法检测 P1 蛋白和 mRNA在各组间的差异。 结果显示低剂量组和高剂量组都能降低 P1表达， 但以高剂量组明显（图3） （n=2）。

3.4 芩百清肺浓缩丸对 P30 基因的影响 收集肺炎支原体，提取 mRNA，使用 reverse transcriptional-PCR方法检测 P30 mRNA表达。 结果显示低剂量组和高剂量都能降低 P30 表达， 但以高剂量组明显 （图4） （n=2）。

3.5 统计分析 reverse transcription-PCR and Western blot使用 Gel-Pro analyzer分析结果。

图3 P1 蛋白和 m RNA的抑制作用Fig.3 Inhibition of P1 Protein and m RNA exPression

图 4 P30 m RNA抑制作用Fig.4 Inhibition of P30mRNA exPression

4 讨论

中医没有支原体肺炎的病名，但从其发病和临床表现可归属于中医学 “咳嗽” 范畴。 从病机角度为外感风热燥毒所致 “肺燥咳嗽”， 故应以清热解毒、润肺止咳为主要治则。肺热清，毒邪解，肺津复，气道爽，肺复清肃之职，则咳嗽、发热等症皆除。按此治则，在临床研究基础上组成治疗儿童支原体肺炎的清热解毒、 润肺止咳代表方药——芩百清肺止咳方， 并制成浓缩丸。 由 SFDA指定的 8家 GCP历时 6 年完成了 653 例 II、Ⅲ期临床试验，获得了临床研究总结报告，数据由上海中医药大学药物临床研究中心郑青山教授统计。结果表明：芩百清肺浓缩丸治疗支原体肺炎总疗效优于阿奇霉素颗粒，与阿奇霉素比较，起效快，改善症状明显。本实验试图从机制上阐明芩百清肺浓缩丸抗肺炎支原体作用，第一次揭示了其降低 P1、 P30 抗肺炎支原体作用。

本实验首先使用 BALB/c小鼠肺组织切片解释芩百清肺浓缩丸能杀灭肺炎支原体治疗支原体肺炎，接着通过对体外实验证明药物作用靶蛋白。药效实验证明芩百清肺浓缩丸的最小抑菌浓度是 100 μg/mL， 抗肺炎支原体作用显著， 具有临床治疗价值，它也确定了体外给药标准。本研究的目标是探讨 P1、 P30 表达， 先前研究发现肺炎支原体导致人类疾病的一个主要原因是它黏附宿主呼吸道上皮，借助黏附细胞器牢固地黏附于上皮细胞表面的受体上，使得肺炎支原体能够在呼吸道上皮细胞定植， 并 由 此 感 染 宿 主［6-10］。 黏 附 细 胞 器 包 括 P1、P30、 HMW1、 HMW2、 HMW3、 HMW4、HMW5 等黏附蛋白，它们在结构和作用上相互合作，共同发挥作用。 其中 P1、 P30 直接与受体结合是黏附所必须的蛋白，它也是重要的免疫原可以诱导机体产生强烈的免疫应答，导致免疫调节机制的异常，最终引起机体肺部和肺外多系统的病变。 HMW是黏附辅 助 蛋 白， 它 不 直 接 参 与 黏 附［11-15］。 利 用 reverse transcription-PCR和 WesternBlot， 知道芩百清肺浓缩丸降低了 P1、P30mRNA和P1 蛋白质表达，特别是高剂量组作用显著。

本研究阐明了芩百清肺浓缩丸通过降低 P1、P30 来抗肺炎支原体， 这个发现提供了芩百清肺浓缩丸如何杀灭肺炎支原体的机制，对于更远的研究提供了理论基础。

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M echanism s of Q inbai Qingfei Pellets inhibiting Mycoplasma pneumoniae

MENG Yan-li， WANG Xin， WANGWei-ming*
（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine， Harbin 150036， China）

AIM To observe the effects of Qinbai Qingfei Pellets（Scutellariae Radix， Stemonae Radix， Platycodi Radix， Pheretima， Ophiopogonis Radix， Asteris Radix et Rhizoma） on both drug-sensitive and drug-resistant strains of Mycoplasma pneumoniae.Mycoplasma pneumoniae ATCC 15531 was used.METHODS After being treated with high-dose and low-dose of Qinbai Qingfeis Pellets， gene and protein expression were measured by real-time quantitative PCR， Reverse Transcription-PCR and Western Blot.RESULTS Both high and low doses of Qinbai Qingfei Pellets greatly decreased P1， P30 expressions as compared with the control group in a dose-dependentmanner.CONCLUSION The experiment finds that P1 and P30 expressions of Mycoplasma pneumoniae can be inhibited by the treatmentwith QinbaiQingfei Pellets to intervene the colonization of upper respiratory endothelial cells.

Mycoplasma pneumoniae； Qinbai Qingfei Pellets； P1； P30

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0036-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.009

2013-02-15

国家重大新药创制专项 （2010ZX09101-104 ）； 黑龙江省青年科学基金 （ QC2011C077 ）； 黑龙江省杰出青年科学基金（JC200813）

蒙艳 丽 （ 1976—）， 女， 助 理 研 究 员， 医 学 硕 士， 研 究 方 向： 新 药 研 发。 Tel： （ 0451 ） 55665478， E-mail： songxy60@ aliyun.com

*通信作者： 王伟明 Tel：（0451）55665478， E-mail： wangweiming475@aliyun.com