TLR3对细胞凋亡相关信号通路的调控

高小姣，陈 莉

(南通大学医学院病理科，江苏南通226001)

Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)首先在果蝇中发现，迄今为止，在人体中发现11 种TLRs［1］。TLRs 家族是物种进化过程中的一个保守家族，每个TLR 成员都是模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)［2］，能够识别某种高度保守的结构，即病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，在固有免疫反应对抗病原微生物，如在细菌，原虫，真菌或病毒中发挥核心作用。

Toll 样受体3(toll like receptor 3，TLR3)是TLR家族中的重要成员，它识别双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)。dsRNA 既可来源于微生物复制中间产物，也可来源于坏死或凋亡细胞。近期研究表明，TLR3 其配体，一种病毒dsRNA 的合成类似物聚肌苷酸聚胞嘧啶核苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，PolyI:C)，通过激活TLR3 可以影响肿瘤细胞的生物学功能［6］，特别是诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长。

1 TLR3 分子的概述

1.1 TLR3 分子的结构

人TLR3 基因由15 944 个核苷酸组成，包含5个外显子组成，编码含有904 个氨基酸蛋白，相对分子质量为125 000 Κα。TLR3 同所有的Toll 样受体一样，都是Ⅰ型跨膜蛋白受体，由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区主要行使识别受体及与其他辅助受体(co-receptor)结合形成受体复合物的功能;跨膜区由21 个氨基酸(705-725)组成，含有大量半胱氨酸;胞内区为含丙氨酸残基的Toll 同源结构域(TH domain)，该结构域和白介素1 受体(interlukin-1 receptor，IL-1R)高度同源，故也被称为Toll/IL-1 受体结构域(toll/IL-1 receptor domain，TIR 结构域)，TIR 具有嗜同性相互作用(homophilic interaction)，借此来募集下游含有TIR 的信号分子，组成信号复合体，参与胞内信号传导。

1.2 TLR3 分子调节的信号通路

TLR3 通过依赖诱导产生IFN-β 的含TIR 结构域的转接蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein including IFN-β，TRIF，又名TIR-domain-containing molecule 1，TICAM1)，即所谓的TRIF 途径［3］。TRIF激活核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)和招募TANK 结合激酶1(TANK-binding kinase1，TBK1)来激活干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)，最终导致IFN-β 产生［4］。已知NF-κB家簇5 个成员分别是NF-κB 1(P50/ P105)、NF-κB 2 (P52/P100)、C-REL、RELA (P65)和 RELB(I-REL)，研究发现在人纤维肉瘤细胞系(HT1080)中存在dsRNA 介导的细胞外和细胞内TLR3 激活两条通路，并且发现两条通路通过不同的NF-κB 成员起作用;在细胞外通路中NF-κB 成员RELA 对IFN-β和其他细胞因子的调控作用是有限的，而NF-κB成员RELB 起负调控作用。相反，细胞内的dsRNA 信号是依赖RELA，而非RELB［5］。

2 TLR3 诱导细胞凋亡的作用

与TLR3 在正常细胞中诱导炎性细胞因子不同，TLR3 信号在癌细胞中明显偏向通过多条途径促进细胞凋亡［12，15］。这种诱导凋亡可能是癌细胞对PolyI:C 或dsRNAs 处理高敏感性的原故。

2.1 TLR3 诱导肿瘤细胞的凋亡作用

在肝癌细胞系SMMC-7721 中，PolyI:C 和三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)联合使用通过TLR3激活和线粒体通路协同触发凋亡，PolyI:C 以剂量依赖形式诱导TLR3，TRIF 过表达和casepase-8 激活及Bcl-2 下调，Bax 上调来促进凋亡［6］。肝癌中TLR3高表达与患者长期生存呈正相关，并引起NK 细胞增生及增加NK 细胞的抗肿瘤活性［7］。这些结果表明TLR3 对凋亡作用是必须的。

在神经母细胞瘤中，dsRNA 抑制瘤细胞生长和促进凋亡，并且在高表达TLR3 的神经母细胞瘤细胞(SK-N-AS)中dsRNA 引起生长抑制和促凋亡作用更明显，TLR3-PKR-IRF3-caspase-3 参与此作用［8］。PolyI:C 能诱导SK-N-AS 细胞中casepase-3、casepase-8 和casepase-9 的激活，但是内源性凋亡途径(线粒体途径)优先参与PolyI:C 诱导的细胞凋亡［9］。内质网功能抑制剂bafilomycin A1 可以有效地阻断casepase-3、casepase-8 和casepase-9 激活，提示在SK-N-AS 细胞中TLR3 可能存在于内质网［9］。不仅如此，在SK-N-AS 细胞中，PolyI:C 激活TLR3有效地抑制细胞迁移和侵袭并且减少微丝组装和丝状伪足形成，TLR3 阳性表达和良好的组织和预后有关［10］。PolyI:C 也可通过抑制sonic Hedgehog(Shh)信号来负调节神经干细胞(neural stem cell，NPC)增生，还可以诱导NPC 凋亡，凋亡与Ras-ERK信号的抑制和Fas 的高表达有关，提示Shh 和TLR3通路之间有信号汇聚［11］。

在转移性头颈癌细胞中，dsRNA 处理后细胞凋亡显著增加，并依赖于TLR3 及其效应蛋白TRIF 和NF-κB 信号的减少，该结果首次表明迁移细胞对dsRNA-TLR3 介导的凋亡特殊敏感［12］。在体外口腔鳞癌细胞中，PolyI:C 主要通过TLR3 激活增加IRF3 磷酸化，产生IFN-β 和激活casepase-3 及casepase-9 来诱导口腔鳞癌细胞的凋亡;同样在口腔鳞癌异种移植小鼠模型中也证实TLR3 激活能抑制口腔鳞状细胞癌生长［13］。并且，在口腔鳞状细胞癌中，PolyI:C 能够提高紫杉醇的抑制效果［14］。

2.2 TLR3 诱导内皮细胞的凋亡作用

内皮前体细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)参与血管形成，在血管修复中发挥作用。EPCs 表达高水平功能性TLR3，PolyI:C 处理EPCs可激活TLR3，通过抑制细胞周期进展和诱导细胞凋亡来减少EPCs 细胞的增生［15］。所以TLR3 促进EPCs 凋亡或许是其激动剂是治疗肿瘤的机制之一。也有研究表明dsRNA 促进人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的凋亡并且抑制HUVEC 形成血管［16］。在人和鼠视网膜色素上皮新生血管中，采用人工合成的dsRNA 或PolyI:C 激活TLR3 可以诱导新生血管内皮细胞凋亡，而在TRIF － / －小鼠中，PolyI:C 诱导的新生血管内皮细胞凋亡明显减少，表明TLR3 和TRIF 参与PolyI:C 诱导的凋亡［17］。但是，滋养细胞中TLR3 信号通路激活诱导可溶性fms 样酪氨酸激酶(sFlt-1)表达，抑制PlGF 表达，导致血管生成障碍，可能参与妊娠期高血压疾病的发生［18］。

2.3 TLR3 诱导免疫细胞的凋亡作用

在人体内凋亡机制对于对免疫活性细胞的动态平衡十分重要。PolyI:C 不仅在体内可以诱导DC凋亡，在体外同样可以诱导DC 凋亡［19］，以免DC 寿命过长而产生自身免疫。Ⅰ型INF 的产生对PolyI:C 诱导的体内DC 凋亡具有重要的作用，在这个过程中需要多种蛋白参与，包括Bim、Puma、Noxa 或Bid 等。巨噬细胞是表达蛋白酶最高的细胞，并且在慢性炎性疾病中是炎性和组织损伤的主要促进剂，TLR3 促进巨噬细胞凋亡可能会减轻慢性炎性疾病的发展［20］。

3 TLR3 激活对细胞自噬的影响

自噬(autophagy)作为Ⅱ型程序性细胞死亡，是真核细胞中一种普遍而又重要的生命现象，其主要作用是清除和降解自身受损的细胞器以及多余的生物大分子，并利用降解产物提供能量和重建细胞结构，在维持细胞稳态和细胞生命活动等方面起重要作用。PolyI:C 处理人前列腺癌细胞诱导凋亡中同时升高Ⅰ型和Ⅱ型微管相关蛋白1 轻链3-β(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，Map1LC3)表达。反之当凋亡被抑制时，由PolyI:C诱导的前列腺癌细胞自噬仍可以持续和/或增强。而且自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)也可以促进PolyI:C 诱导的前列腺癌细胞凋亡［21］。β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白(TIR-domaincontaining adaptor protein including IFN-β，TRIF)与点状亚细胞结构中的LC3 至少部分共定位，泛素蛋白1(ubiquilin 1 or PLIC-1)通过减少自噬途径中信号衔接分子TRIF 来实现对TLR3-TRIF 信号通路的抑制，这些结果表明自噬并不是TLR3 激活的结果，而是TLR3 信号通路的交谈作用或旁路步骤发挥的作用［22］。

4 问题与展望

抗微生物肽LL37 是唯一已知的人类抗菌肽家族成员，在外周血单核细胞中，LL37 提高PolyI:C 以TLR3 依赖方式诱导的细胞因子反应，在人支气管上皮细胞(BEAS2B)中，LL37 也与dsRNA 和TLR3 共定位，在体外，LL37 与dsRNA 形成复合体并且改变dsRNA 的构象，潜在促进其识别TLR3［23］。在病毒感染的细胞中，细胞内酶ADAR-1 的激活引起含有次黄嘌呤的RNA(Ino-RNA)出现，SS-Ino-RNA 是一种新的病毒识别原件，它通过TLR3 发挥抗病毒作用，它是一个还没有记载的病毒相关先天免疫刺激;含高次黄嘌呤的RNA 在正常生长的真核细胞中通常不被发现，但在DNA 和RNA 病毒感染期间会出现［24］。

在肿瘤发生、发展的过程中，细胞自噬的作用具有双向性，一方面细胞自噬防止有毒或致癌的损伤蛋白质和细胞器的累积，抑制细胞癌变;另一方面自噬亦可通过限制坏死和炎性反应促使肿瘤细胞存活于代谢性应激或免疫抑制中，促进肿瘤生长［25］。PolyI:C 既可诱导凋亡又可促进自噬，自噬和凋亡之间又有着复杂的关系［21-23］，TLR3 对细胞增生又存在双重效果，有可能促进，有可能抑制，所以，对PolyI:C 作用于癌症的机制及最终结果的研究十分重要。另外，近年来siRNA 用于实验研究得到了广泛关注，siRNA 也是一种dsRNA，有可能激活TLR3，产生干扰素效应，所以要排除此影响。

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