大鼠角膜穿通伤后局部应用IL-10抑制视网膜炎症和抗神经溃变的研究

黄燕，周月鹏，肖寿华，张志坚

（1．江苏大学附属医院眼科，江苏镇江212001；2．江苏大学附属医院检验科，江苏镇江212001；3．江苏大学医学院，江苏镇江212013）

大鼠角膜穿通伤后局部应用IL-10抑制视网膜炎症和抗神经溃变的研究

黄燕1，周月鹏2，肖寿华1，张志坚3

（1．江苏大学附属医院眼科，江苏镇江212001；2．江苏大学附属医院检验科，江苏镇江212001；3．江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的：观察角膜穿通伤后局部应用IL-10对视网膜炎症反应的抑制和对神经溃变的保护作用。方法：将清洁级成年雌性SD大鼠50只，随机分为对照组（8只）、损伤组和治疗组，后两组（每组21只）再分为损伤1 d、2 d和3 d组（每小组7只）。损伤组用无菌注射器刺穿眼球颞侧角膜缘角膜，制作角膜穿通伤模型。治疗组在角膜穿通伤后用IL-10溶液滴眼。各组2只大鼠用于制作眼球切片，免疫荧光染色观察角膜穿通伤后炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及神经丝蛋白-200（neurofilament protein-200，NF-200）、血影蛋白（α-Ⅱspectrin）及钙蛋白酶2（m-calpain）在视网膜中的分布特征；另5只大鼠用于提取视网膜蛋白，采用免疫印迹法检测各组大鼠于角膜穿通伤24，48，72 h后，视网膜组织内NF-200和血影蛋白降解产物以及活性钙蛋白酶2相对含量的动态变化。结果：对照组视网膜结构层次清楚，IL-1β、IL-6、TNF-α和m-calpain免疫荧光很弱；血影蛋白和NF-200免疫荧光染色可清晰显示阳性神经纤维；角膜穿通伤后，视网膜结构层次模糊，TNF-α、IL-1β，IL-6和m-calpain免疫荧光增强，主要分布在内层；NF-200和血影蛋白免疫荧光染色显示阳性神经纤维明显减少；IL-10治疗后，TNF-α、IL-1β，IL-6和m-calpain免疫荧光减弱，血影蛋白和NF-200阳性神经纤维明显多于损伤组。免疫印迹检测结果表明，损伤组视网膜组织内大分子的NF-200和血影蛋白含量逐渐减少，其小分子的降解产物以及小分子的活性m-calpain逐渐增加；在IL-10治疗组，NF-200和血影蛋白的降解产物以及活性m-calpain的增加程度明显减轻。结论：角膜穿通伤可刺激视网膜细胞高表达炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α，导致组织的炎症损伤，同时激活m-calpain，后者降解视网膜细胞骨架蛋白NF-200和血影蛋白，造成神经溃变；局部应用IL-10可减轻炎症反应，抑制m-calpain对骨架蛋白的降解，从而对视网膜细胞产生保护作用。

角膜穿通伤；视网膜；炎症；神经溃变；白介素-10；大鼠

各种组织和器官的原发性损伤均可使机体产生全身和局部的应激反应，刺激损伤组织细胞过度表达各种炎症因子，引起炎症反应，造成原发性损伤组织及其周边组织的继发性损伤。眼球穿通伤是一种常见的眼外伤，如果不进行有效的治疗将会导致严重的继发性损伤，如视网膜神经溃变。我们先前的研究发现，大鼠角膜穿通伤可刺激眼球壁组织分泌热休克蛋白90和大量炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α），导致视网膜产生炎症损伤，并激活钙蛋白酶2（m-calpain），降解视网膜神经细胞中的骨架蛋白，如神经丝蛋白-200（neurofilament protein-200，NF-200）和血影蛋白（α-Ⅱspectrin）等，最终导致神经溃变［1－2］。已有文献报道，IL-10为重要的抗炎因子，可抑制炎症因子的产生，减轻组织损伤后的炎症反应［3］。IL-10还具有神经营养作用，可以防止神经溃变和促进神经再生［4－7］。本研究基于IL-10的上述生物学作用，在大鼠角膜穿通伤后，局部应用IL-10，观察其抑制视网膜炎症反应和抗神经溃变的疗效，为临床应用IL-10治疗角膜穿通伤导致的继发性视网膜损伤提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1．1 主要试剂

兔抗m-calpain抗体、小鼠抗NF-200单克隆抗体、小鼠抗血影蛋白单克隆抗体及小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品；兔抗小鼠IgG-cy3、羊抗兔IgG-cy3为Sigma公司产品；羊抗兔IgG-HRP、兔抗小鼠IgG-HRP购自武汉博士德生物工程有限公司。

1．2 实验动物及分组

清洁级成年雌性SD大鼠50只（100眼），由江苏大学实验动物中心提供，体质量为250 g左右。所有大鼠均健康、无眼疾，饲养与使用均遵照视觉与眼科研究协会制定的科研动物使用规范。将大鼠随机分为正常对照组（8只），角膜穿通伤组（损伤组）和IL-10治疗组，后两组（每组21只）再分为损伤1 d、2 d和3 d组。

1．3 动物模型的制作方法

制作模型前24 h大鼠眼部涂抹红霉素眼膏预防感染。经0．3%戊巴比妥钠（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，双侧眼眶周围采用碘伏消毒，用75%的乙醇脱碘，0．4%盐酸奥布卡因滴眼液结膜囊表面麻醉，无菌生理盐水冲洗双眼结膜囊。在双眼颞侧（左眼3点钟方向，右眼9点钟方向）角膜缘前2 mm处用1 mL无菌注射器迅速刺穿角膜，针尖指向鼻侧，进针约0．5 mm，眼球内无出血、有房水外溢为造模成功，术后眼部涂抹红霉素眼膏预防感染。IL-10治疗组于角膜穿通伤后立即给予球旁注射质量浓度为10μg／mL的IL-10液体10μL（净含量为100 ng），并每隔12 h用微量注射器给予伤眼上述浓度液体20μL滴眼，滴眼后眼浴1 min。对照组用生理盐水代替IL-10治疗。

1．4 眼球的取材、切片制作及免疫荧光染色

正常组、角膜穿通伤组和IL-10治疗组大鼠按预定时间，以0．3%戊巴比妥钠（30 mg／kg）麻醉，经左心室-主动脉弓依次灌注生理盐水400 mL和4℃的4%低聚甲醛溶液400 mL后摘取眼球，并置入4%低聚甲醛溶液中，4℃固定24 h。将固定后的眼球取出置入30%蔗糖磷酸盐缓冲液中4℃浸泡12 h，至眼球下沉后取出。经OCT包埋后在恒冷箱切片机（Leica公司）中沿瞳孔视神经轴进行切片，片厚20μm，贴片、晾干6 h后将眼球组织切片置入4℃的4%低聚甲醛溶液中固定2 h，按以下步骤进行免疫荧光染色：磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗切片5 min，0．25%TritonX-100溶液37℃孵育1 h，PBS漂洗5 min；用3%牛血清白蛋白溶液37℃封闭1 h。分别用抗炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、抗细胞骨架蛋白NF-200、血影蛋白和抗m-calpain的抗体4℃孵育过夜，再37℃孵育1 h，PBS漂洗5 min后分别用Cy3标记的相应第二抗体（1∶300稀释度）孵育1 h，PBS漂洗5 min，用Hochest33342复染细胞核，PBS漂洗5 min，中性甘油封片。阴性对照用PBS代替第一抗体，其余步骤同上。染色后切片用Leica荧光显微镜观察上述蛋白在视网膜的分布。

1．5 视网膜组织蛋白的提取和免疫印迹检测

各组大鼠分别用0．3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，摘取眼球，切开眼球壁，剥离视网膜组织，放入含100μL 4℃裂解液的EP管，用超声粉碎仪于冰浴中粉碎组织，将裂解后的视网膜组织匀浆于4℃离心后吸取上清，与等体积2×电泳上样缓冲液混匀后煮沸5 min，使蛋白变性，－70℃冻存备用。常规配置8%聚丙烯酰胺凝胶，以每泳道10μL等体积上样，电泳并转膜。用脱脂奶粉溶液封闭已转印蛋白的PVDF膜1 h。分别用抗NF-200、血影蛋白和抗m-calpain抗体（1∶200）室温孵育2 h，同时用GAPDH抗体（1∶200）孵育，以显示内参条带；再用HRP标记的相应第二抗体（1∶5 000），室温孵育1 h，用ECL增强发光剂显示蛋白条带，用Typhoon 9400分子成像系统（美国通用公司）扫描，保存图片。测定目的蛋白免疫印迹条带的光密度值。NF-200和血影蛋白降解产物以及活性m-calpain的相对含量用小分子质量蛋白条带的光密度值与大分子质量蛋白条带的光密度值比值的均数表示。

1．6 统计学处理

采用SPSS 13．0统计软件，对各组大鼠视网膜组织内目的蛋白的小分子质量蛋白条带的光密度值与大分子质量蛋白条带的光密度值比值进行配对t检验，分析各组间、组内的NF-200和血影蛋白降解产物以及活性m-calpain的相对含量差异，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 视网膜组织切片的免疫荧光染色结果

正常对照组视网膜结构层次清楚，IL-1β、IL-6和TNF-α免疫荧光很弱。角膜穿通伤后24、48和72 h组的视网膜组织结构免疫荧光表达存在差异，其中变化明显的时间段为损伤后48 h。角膜穿通伤后48 h，IL-1β、IL-6和TNF-α免疫荧光明显增强，主要分布在双极细胞层、节细胞层和视神经纤维层；IL-10治疗后，IL-1β、IL-6和TNF-α免疫荧光明显减弱（图1）。在正常对照组，NF-200和血影蛋白免疫荧光染色可清晰显示视神经纤维层的阳性神经纤维，m-calpain免疫荧光很弱；角膜穿通伤后48 h，NF-200和血影蛋白免疫荧光染色显示阳性神经纤维明显减少，m-calpain免疫荧光明显增强；IL-10治疗后，NF-200和血影蛋白阳性神经纤维明显多于损伤组，m-calpain免疫荧光较损伤组减弱（图2）。

2．2 免疫印迹检测结果

在损伤组，视网膜组织内大分子质量的NF-200和血影蛋白含量逐渐减少，其小分子质量的降解产物以及小分子质量的活性m-calpain逐渐增加；在IL-10治疗组，NF-200和血影蛋白的降解产物以及活性m-calpain的增加程度明显减轻（图3）。

统计学处理结果表明，IL-10治疗组的小分子NF-200（表1）和血影蛋白（表2）降解产物以及活性m-calpain（表3）的相对含量明显低于损伤组（P＜0．05）。我们前期的实验已观察过对照组与损伤组间的蛋白表达存在差异［2］，故本文只列出损伤组与治疗组间蛋白表达差异。

表1 大鼠视网膜NF-200降解产物的相对含量n＝5±s

24 h 48 h 72 h损伤组组别1．35±0．15 1．57±0．18 5．17±0．53治疗组 0．75±0．07 1．15±0．13 1．87±0．18 t值8．10 4．23 13．18 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

表2 血影蛋白降解产物的相对含量 n＝5，±s

24 h 48 h 72 h损伤组5．15±0．65 8．71±0．85 13．57±1．35治疗组 1．95±0．21 5．15±0．47 7．19±0．75 t值10．40 8．19 9．24 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05组别

表3 大鼠视网膜活性钙蛋白酶2相对含量n＝5，±s

24 h 48 h 72 h损伤组组别2．15±0．15 2．75±0．19 3．55±0．33治疗组 1．35±0．11 1．73±0．18 2．19±0．23 t值9．62 8．71 7．56 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

3 讨论

已有研究结果表明，角膜穿通伤可引起眼球组织的应激反应，刺激组织细胞产生多种炎症因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等［1］。上述炎症因子可损伤细胞膜，导致细胞内Ca2＋超载，激活钙依赖性蛋白酶m-calpain［8－9］。激活的m-calpain亦可以促进上述因子的过度表达，从而形成恶性循环，加重组织损伤［10］。此外，激活的m-calpain可降解神经细胞中NF-200和血影蛋白等骨架蛋白，造成神经细胞的坏死和神经纤维的溃变［11－15］。因此，应用药物抑制眼球损伤后的眼球壁组织炎症因子的表达，减轻细胞内Ca2＋超载，将可降低m-calpain的活性，减轻NF-200和血影蛋白等骨架蛋白的降解，对视网膜神经细胞和神经纤维起到保护作用。

IL-10是一重要的抗炎因子，可抑制促炎因子的产生，发挥下调炎症反应的生物学作用［3］。新近的研究表明，IL-10除了抑制炎症反应以外，还具有抑制组织损伤后细胞内Ca2＋超载的作用，应用IL-10可通过降低钙蛋白酶和caspases活性，减轻脑缺氧导致的神经细胞凋亡［16－18］。IL-10还具有直接的神经营养作用和促进神经细胞分化和突触形成的作用［19－20］。本研究利用IL-10的上述抗炎和对神经细胞损伤的保护作用，在角膜穿通伤后局部应用IL-10药液滴眼，以评价其对角膜穿通伤后视网膜炎症损伤和神经溃变的治疗效果。实验结果表明，角膜穿通伤后，视网膜细胞广泛表达炎症因子TNF-α、IL-1β，IL-6和钙蛋白酶m-calpain，同时NF-200和血影蛋白免疫荧光染色显示视网膜的阳性神经纤维明显减少，说明角膜穿通伤可导致视网膜炎症损伤和神经纤维的溃变；IL-10治疗后，上述炎症因子和mcalpain免疫荧光明显减弱，血影蛋白和NF200阳性神经纤维明显多于损伤组。免疫印迹检测结果亦显示IL-10治疗后，视网膜组织内NF-200和血影蛋白的降解产物以及活性m-calpain相对含量减少。

综上所述，IL-10可抑制角膜穿通伤导致的视网膜炎症因子的表达，降低m-calpain的活性，减轻NF-200和血影蛋白的降解，防止视网膜神经细胞的坏死和神经纤维的溃变。本研究结果为临床应用IL-10治疗角膜穿通伤导致的继发性视网膜损伤提供了实验和理论依据。

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Topical application of IL-10 inhibits inflammation and reduces neural degeneration of the retina after corneal penetrating injury in rats

HUANG Yan1，ZHOU Yue-peng2，XIAO Shou-hua1，ZHANG Zhi-jian3
（1．Department of Ophthalmology，2．Department of Laboratory，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；3．School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the mechanisms of that IL-10 inhibits inflammation and reduces neural degeneration of the retina after corneal penetrating injury in rats．M ethods：A total of 50 adult female ratswere randomly divided into three groups：A，the normal control group（8 rats）；B，the corneal penetrating injury group（21 rats）；and C，the IL-10 treated group（21 rats）．B and C groupswere subdivided into the subgroups suffered from corneal penetrating injury for 24 hours，48 hours and 72 hours，respectively．The animals of C group suffered from corneal penetrating injury and then were treated with topical application of IL-10．Two rats in each group were used tomake tissue sections of eyeball．The sections were immunofluorescence stained with antibodies against IL-1β，IL-6，TNF-α，neurofilament protein-200（NF200），α-Ⅱspectrin and m-calpain．The relative contents of activated m-calpain and the degradationproducts of NF200 andα-Ⅱspectrin of the retina tissueswere detected by western blotting．Results：The immunofluorescence staining of IL-1β，IL-6，TNF-αand m-calpain in normal retina were very weak，and became stronger in the retina of corneal penetrating injury groups．After treated with IL-10，the intensity of immunofluorescence staining of IL-1β，IL-6，TNF-αand m-calpain reduced．The immunofluorescence staining of NF200 andα-Ⅱspectrin wereweaker in the corneal penetrating injury group than those in the normal group；after treated with IL-10，the intensity of immunofluorescence staining of NF200 andα-Ⅱspectrin became stronger than those in the corneal penetrating injury group．Western blotting showed that the relative contents of activated m-calpain and the degradation products of NF200 andα-Ⅱspectrin of the retina tissues in IL-10 treated group were lower than those in the corneal penetrating injury group．Conclusion：The expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-αwere up-regulated after corneal penetrating injury and then activate them-calpain localized in retinal tissues．The activatem-calpian could degrade the cytoskeleton proteins NF200 andα-Ⅱspectrin leading to nerve degeneration of retina；treatmentwith topical application of IL-10 could reduce the expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-αand inhibit the activity ofm-calpian，which protect the animals from nerve degeneration of the retina after corneal penetrating injury．

corneal penetrating injury；retina；inflammation；neural degeneration；IL-10；rat

R774．1

A

1671－7783（2014）06－0461－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140269

江苏大学临床医学科技发展基金资助项目（JLY2010146）

黄燕（1972—），女，江苏镇江人，主治医师，主要从事眼科疾病临床研究；肖寿华（通讯作者），主任医师，E-mail：0511syj＠163．com

2014－09－21 ［编辑］ 陈海林