芦荟大黄素对非酒精性脂肪性肝炎细胞模型脂质过氧化损伤的影响

戴娜，周培，张莹莹，王炳芳

（1．江苏大学附属昆山医院消化内科，江苏昆山215300；2．江苏大学研究生院，江苏镇江212013）

芦荟大黄素对非酒精性脂肪性肝炎细胞模型脂质过氧化损伤的影响

戴娜1，周培2，张莹莹2，王炳芳1

（1．江苏大学附属昆山医院消化内科，江苏昆山215300；2．江苏大学研究生院，江苏镇江212013）

目的：探讨芦荟大黄素（aloe-elodin，AE）对非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）细胞模型脂质过氧化损伤的影响。方法：将正常人肝细胞株L-02分为对照组和实验组，对照组用普通培养基，实验组按培养基含30%脂肪乳剂终浓度不同再分为0．25，0．5，0．75，1mL／L组，培养72 h后予以油红O染色，观察细胞形态和细胞内脂肪滴数量，测定培养液谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、三酰甘油含量。选择最合适浓度（0．5 mL／L组）建立NASH模型，再设立对照组、模型组、实验组，实验组加入10－4，10－5，10－6mmol／L的AE，分别于培养24，48，72 h监测细胞内脂滴数量、三酰甘油含量和细胞培养液中ALT、AST、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛、内毒素、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等指标。结果：用含30%脂肪乳剂0．5 mL／L的培养液培养L-02细胞株72 h，成功建立NASH肝细胞模型。不同浓度AE干预NASH细胞72 h后，培养液中ALT、AST、丙二醛、内毒素、TNF-α等含量均较模型组明显下降，SOD含量较模型组明显升高（P＜0．05）。结论：AE可改善肝细胞脂质过氧化程度，减轻炎症反应及细胞损伤。

非酒精性脂肪肝炎；芦荟大黄素；细胞模型；细胞损伤

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的肝损伤因素引起的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征，以肝实质细胞脂肪贮积和脂肪变性为特征的临床病理综合征。NAFLD疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）和潜在的肝硬化［1］。NASH是指肝组织病理学变化与酒精性脂肪性肝炎相似，但无明确饮酒史的一种获得性代谢疾病［2］。

芦荟大黄素（aloe-elodin，AE）是芦荟的主要泻下成分之一。Arosio等［3］研究发现，AE对四氯化碳引起的小鼠急性肝损害有防护作用，不仅能阻止肝细胞死亡，还能防护脂质过氧化导致的炎症反应。许丹等［4］通过制作血吸虫病性肝纤维化小鼠模型，利用AE治疗，发现治疗后病理程度和范围均明显减轻，肝组织丙二醛明显减少，肿瘤生长因子β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子和局部粘着斑激酶的表达均减少。据此，本研究拟探讨AE对肝细胞的保护作用，以脂肪乳剂诱导体外NASH细胞模型，通过测定培养液中谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛、内毒素、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等指标，了解肝细胞损伤程度，并设平行实验组予以不同浓度AE干预受损肝细胞，检测培养液中上述指标浓度，研究AE对损伤肝细胞修复以及对肝细胞脂质代谢的影响。

1 材料与方法

1．1 材料

人健康肝细胞株L-02购自中科院细胞研究所细胞库，改良RPMI 1640培养基和胎牛血清（新西兰进口）购自北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司，30%中长链脂肪乳注射液购自华瑞制药有限公司，细胞裂解液购自上海碧云天公司，油红O试剂、T4424胰酶为美国Sigma公司产品，98%AE购自上海士锋生物科技有限公司，三酰甘油、AST、ALT试剂盒均为罗氏公司产品，SOD、丙二醛、内毒素及TNF-αELISA试剂盒购自南京建成公司，显微镜为奥林巴斯DP72，CO2恒温箱为三洋MCO-15AC，Biobase超净工作台。

1．2 方法

1．2．1 肝细胞培养 将人正常肝细胞株L-02接种于培养瓶，用含100 mL／L小牛血清、青链霉素各10 U／L的RPMI 1640培养，待细胞融汇至80%时，用0．25%EDTA胰酶消化，传代培养。

1．2．2 NASH离体细胞模型的建立 参照本实验室既往NASH模型建立方法［5］，并加以改进。将离体培养的肝细胞接种于6孔板，行细胞爬片培养，设空白对照组和实验组。空白对照组用正常1 640培养基培养，实验组按照培养基中含30%脂肪乳剂浓度不同分4组：0．25 mL／L组，0．5 mL／L组，0．75 mL／L组，1．0 mL／L组。待细胞长满至70%左右时，用含脂肪乳剂的培养基干预，于24、48、72 h分别行油红O染色。具体方法：将载玻片常温干燥10 min，75%乙醇孵育10 s，油红O染色工作液避光孵育10～15 min，再用75%乙醇分化数秒（至背景无色），水洗2min，苏木素复染10min，水洗，盐酸乙醇分化，用纸巾吸去周边水分，观察脂滴数量，细胞形态，并于72 h收集细胞培养液，检测培养液中ALT、AST含量。

以最低脂肪乳剂浓度致肝细胞脂肪变性，并有ALT、AST升高，细胞状态良好为原则，选择最佳浓度（0．5 mL／L）建立NASH模型。

1．2．3 AE干预NASH细胞模型 在上述NASH细胞模型建立基础上分5组进行实验，分别为空白对照组（1640正常培养基），NASH模型组，3个实验组，即NASH模型组＋AE，AE终浓度分别为10－4、10－5、10－6mmol／L；每个浓度设3个平行组，分别于培养24、48、72 h测上清液中ALT、AST、SOD、丙二醛、内毒素、TNF-α含量。

1．2．4 细胞培养液中ALT、AST、SOD、丙二醛、TNF-α、内毒素检测 分别于培养24，48，72 h收集6孔板中各浓度的细胞培养液，AST、ALT的检测按照相应试剂盒说明书加样后，由全自动生化分析仪自动检测并计算结果。培养液低温离心后，SOD、丙二醛、TNF-α、内毒素的含量采用ELISA法检测，严格按试剂盒指示说明进行操作。

1．2．5 肝细胞内三酰甘油含量检测 待培养瓶中细胞长至70%左右时分别予正常1640培养基、0．5 mL／L脂肪乳剂培养基、不同浓度的AE（10－4、10－5、10－6mmol／L）培养；每个浓度设3个平行组，第3天离心，收集肝细胞，用250μL裂解液裂解，再次离心后由全自动生化分析仪自动检测并计算细胞内三酰甘油的含量。

1．3 统计学方法

2 结果

2．1 NASH模型中细胞的形态

细胞培养72 h，油红O染色结果显示，对照组细胞边缘清晰，呈铺路石样多角形排列，核大，细胞内未见红色脂滴。0．25 mL／L组肝细胞形态基本同对照组，胞质内微量脂滴。0．5 mL／L组细胞边缘清晰，大部分细胞变圆，细胞间结合欠紧密；细胞内红色脂滴较多，部分细胞内脂滴成环状位于细胞膜内侧，可见较大的脂滴。0．75 mL／L组有部分细胞破裂，细胞间结合不紧密，细胞内脂滴较多较大，偶见较多脂滴将细胞核挤向一侧，呈印戒样改变。1．0 mL／L组细胞较稀疏，较多细胞破裂，染色后见脂滴更大，脂肪堆积更明显，可见脂滴片状融合，泄漏于胞外。因此，本实验选择0．5 mL／L作为致肝细胞脂肪变性最佳浓度。见图1。

2．2 不同浓度脂肪乳剂培养基作用后细胞上清液中ALT、AST的含量变化

细胞培养72 h后，细胞上清液中ALT、AST含量较对照组明显升高，其中以0．5 mL／L组升高最为明显，0．75 mL／L组及1．0 mL／L组由于脂肪乳剂浓度太高，抑制细胞生长，致细胞上清液中ALT、AST的升高无0．5 mL／L明显，见图2。故选用0．5 mL／L浓度建立NASH肝细胞模型。

2．3 不同浓度AE干预后NASH模型细胞中各检测指标含量的变化

AE干预NASH模型后，随着作用时间延长，10－4mmol／L AE组及10－5mmol／L AE组细胞培养液中ALT和AST含量均较模型组明显降低，10－6mmol／L AE组较模型组无明显降低。随着脂肪乳剂作用时间的延长，模型组细胞上清液中丙二醛含量明显增加，SOD含量明显降低。随AE浓度增加，细胞上清液中丙二醛含量下降，SOD含量增加，呈一定的浓度时间效应关系，其中10－4mmol／L AE组作用72 h抗脂质过氧化作用最明显。此外，AE各组细胞上清液中TNF-α、内毒素的含量明显低于模型组，且同一时间点AE的浓度越高，含量越低，其中以10－4mmol／L AE组作用72 h抗炎效果最佳。见图3。

2．4 不同浓度AE干预NASH细胞模型后三酰甘油含量变化

细胞培养72 h后，各AE浓度组肝细胞内三酰甘油的含量较模型组明显降低，且AE浓度越高，抗脂质沉积的作用越强。见图4。

3 讨论

在过去的10年中，NAFLD发病率呈逐年升高趋势，已成为全球慢性肝病最常见的疾病之一［6－7］。西方国家患病率约20%～34%，为肝酶异常的首要原因［8－9］，我国患病率为15%～20%，40岁以上男性患病率高达30%，且近年来呈年轻化趋势［10］。NAFLD病理上表现为单纯的肝细胞内脂肪堆积或伴有不同程度的坏死性炎症和可能存在的纤维化［6－7，11－12］。NASH病理表现为肝脏细胞的氧化损伤，炎症和活化纤维形成［13－14］。目前，关于NAFLD发生发展的病理生理机制尚不清楚［15－16］，有假说认为，NAFLD是由于输送到肝脏的游离脂肪酸增多，肝细胞脂肪酸代谢紊乱，或从头合成增加，致三酰甘油在肝细胞内堆积所引起［17］。最新研究表明，NAFLD是一种复杂的多因素疾病，其发生、发展由多种因素共同作用，包括主体因素（基因多态性）、环境因素以及生活方式（如饮食习惯）等。其中，基因多态性主要与机体氧化应激、炎症和先天免疫反应的差异相关［11，18］，这些因素的综合作用促进了非酒精性脂肪肝的形成及进一步向NASH发展［15］。故建立NAFLD和NASH体外细胞模型对研究NAFLD和NASH的发病机制及防治具有重要的理论意义与广泛的实用价值。

目前对于酒精性脂肪肝以及NASH的研究多见于动物实验，但动物模型存在个体差异较大、实验条件不易控制、外界影响因素多、实验周期长等不利因素。因此，本研究采用NASH细胞模型进行实验，可最大限度减少个体差异和其他外界因素对实验结果的影响，并可直观肝细胞脂肪变性的过程以及肝细胞损伤。根据NAFLD的发病机制，本实验采用加入不同浓度脂肪乳剂的培养液培养肝细胞，短期内即可致肝细胞累积大量三酰甘油，并伴有ALT、AST升高，随培养时间延长，细胞内脂质代谢紊乱越明显，形成体外脂肪肝模型。此外，本实验还发现，培养液中脂肪乳剂浓度过低或过高均不利于建立NASH模型，过低对肝细胞影响较小，过高除影响观察视野外，还会造成细胞大量死亡，这可能与细胞对生长环境要求较高及脂肪毒性有关。

本实验在肝细胞脂肪变性基础上继续予以含脂肪乳剂培养基培养，培养后测得培养液中ALT、AST、丙二醛，TNF-α，内毒素含量增加，SOD含量下降，细胞损伤加重，且随培养时间延长上述变化越明显，模拟出体内过氧化物增多引发的二次打击导致NASH的发病过程，成功建立NASH细胞模型；AE干预结果显示，AE可抑制培养液中ALT、AST、丙二醛，TNF-α，内毒素含量增加及SOD含量下降，其抑制作用与AE浓度相关。与模型组相比，AE各组细胞损伤减轻，随AE浓度升高，作用越明显，由此可见，AE对NASH细胞模型具有明显的保护作用，从细胞水平证明AE能改善NASH的炎性反应及脂质过氧化损伤。

本实验在成功建立NASH离体细胞模型的基础上，从细胞水平观察不同浓度AE对NASH细胞模型脂质过氧化损伤和炎症反应的影响。当然，细胞实验也存在一定的局限性，例如，不可避免地存在细胞凋亡及实验操作对细胞培养结果的影响，需要反复多次实验，增加细胞培养量以减少误差。此外，加入AE的浓度及检测各数值的时间截点，均有待于进一步摸索和完善。

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Effect of aloe-elodin on non-alcoholic steatohepatitis cellsmodel

DAINa1，ZHOU Pei2，ZHANG Yin-yin3，WANG Bin-fang1
（1．Department of Gastroenterology，the Affiliated Kunshan Hospital of Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300；2．Graduate School of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To study the effect of aloe-emodin（AE）on non-alcoholic steatohepatitis cell model．M ethods：Thirty percent fat emulsion were added into the culture medium cultured normal human liver cell line L-02，then the cellswere divided into control group and experiment groups in which culture medium containing 30%fat emulsion at different concentrations，which were 0．25ml／L，0．5 mL／L，0．75 ml／L，1．0 ml／L，respectively．After 72 hours culture，the cellswere stained by oil red O，then observed themorphology and the intracellular lipid droplets；and mesured the alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），triglyceride（TG）contents in liquid culture；choosed themostappropriate concentration of 30%fat emulsion（0．5 mL／L FA group）to establish the nonalcoholic steatohepatitismodel．Then the cellswere randomized into the control group，model group and experimental groups in which culturemedium the concentrations of aloe emodin were 10－4mmol／L，10－5mmol／L，10－6mmol／L，respectively．The number of intracellular lipid droplets，triglyceride contentand indicators of ALT，AST，superoxide dismutase（SOD），malonaldehyde（MDA），endotoxin，tumor necrosis factor-α（TNF-α）in culture medium were determined．Results：The model of NASH liver cells were successfully established．Three groupswere added with different concentration of AE intervention，after 72 hours，their ALT，AST，MDA，endotoxin，TNF-αin liquid culture decreased，SOD content increased compared with themodel group（P＜0．05）．Conclusion：AE could improve liver cell lipid peroxidation degree，and reduce inflammation andcell damage，which correlated positively with the time and concentration，within a given range．

non-alcoholic steatohepatitis；aloe-elodin；cellmodel；cell injury

R575．1

A

1671－7783（2014）06－0478－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140200

戴娜（1981—），女，江苏昆山人，主治医师，硕士，主要从事非酒精性脂肪性肝炎的研究；王炳芳（通讯作者），主任医师，硕士生导师，E-mail：shbingfang＠163．com

2014－07－08 ［编辑］ 刘星星