胰岛素控制血糖对糖尿病大鼠阴茎勃起功能障碍的防治*

田文杰王 林李辉喜雷洪恩关瑞礼许永德那万里**辛钟成**

1. 吉林大学中日联谊医院泌尿外科（长春 130033）; 2. 北京大学第一医院泌尿外科

·论 著·

胰岛素控制血糖对糖尿病大鼠阴茎勃起功能障碍的防治*

田文杰1王 林2李辉喜2雷洪恩2关瑞礼2许永德2那万里1**辛钟成2**

1. 吉林大学中日联谊医院泌尿外科（长春 130033）; 2. 北京大学第一医院泌尿外科

目的观察利用胰岛素严格控制血糖对糖尿病性勃起功能障碍（DMED）防治效果。方法 年龄8周的健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，STZ腹腔注射诱导糖尿病，监测血糖两个月诱导DMED模型，分正常对照组（NC），糖尿病安慰剂治疗组（DM），糖尿病胰岛素治疗组（DM-Inshulin）胰岛素每次2～6个单位，一天2次腹腔注射，连续治疗4周，早晚监测血糖。治疗结束后检测阴茎海绵体神经刺激下阴茎海绵体内压与平均动脉血压（ICP/MAP）评估勃起功能。留取阴茎组织进行组织学检测。结果DM-Insulin组大鼠血糖和糖化血红蛋白得到有效控制，虽然勃起功能（以ICP/MAP检测）比较DM 组有所改善，但是比较NC组显著降低。DM-Insulin组大鼠阴茎海绵体内皮细胞标记物vWF、平滑肌等组织学病理变化及组织细胞凋亡指数比较DM组显著改善，但仍未恢复至NC组水平。结论糖尿病大鼠利用胰岛素严格控制血糖水平，可部分改善阴茎勃起功能和阴茎海绵体病理变化，但是不能完全修复勃起功能障碍的病理变化，这可能与糖尿病糖基化终末产物及其受体（AGE-RAGE）相关代谢记忆有关，有待于进一步深入研究。

勃起功能障碍; 糖尿病; 胰岛素

据调查显示40～70岁男性中有52%受勃起功能障碍（Erectile dysfunction，ED）的困扰，其中接近50%表现为器质性勃起功能障碍，其涉及勃起神经病变、阴茎海绵体损伤性病理变化及内皮细胞损伤等[1]。ED是糖尿病（Diabetes mellitus，DM）的常见早期并发症之一，其患病率为正常男性的3倍[2]。对于糖尿病性勃起功能障碍（DMED）近年来作为广泛用于勃起功能的治疗口服磷酸二酯酶5型抑制剂如西地那非以及阴茎海绵体药物注射疗法效果不佳，严重危害生活质量和家庭和谐，常需阴茎起搏器植入手术治疗[3]。但昂贵的手术治疗费用，使阴茎起搏器植入手术治疗在我国显然无法成为常态化的治疗方式，无法满足大多数患者的治疗需求。

传统观念认为利用胰岛素等药物有效地控制血糖，且期待能够防治糖尿病并发症[4]。但是临床上糖尿病患者虽然利用胰岛素等药物治疗有效控制血糖，但是不能完全防治糖尿病合并症，而且欧美前瞻性临床研究结果也观察到这种结果，但是其机制目前还需要深入研究[5,6]。

DMED的病理学变化涉及高血糖引起糖基化终末产物（AGE）堆积，糖基化终末产物受体（RAGE）表达增加，引起氧化应激反应，导致阴茎海绵体病理变化、内皮细胞功能障碍及神经病变引起ED[7]。

本研究建立糖尿病性ED模型，利用胰岛素有效血糖控制，检测神经刺激下的阴茎勃起血流动力学变化，并通过组织学和分子学改变评估胰岛素对阴茎海绵体内皮细胞、平滑肌及细胞凋亡的影响，观察胰岛素对糖尿病性ED的防治效果。

材料与方法

一、实验试剂及仪器

精蛋白生物合成人胰岛素注射液（丹麦诺和诺德公司）；戊巴比妥钠（北大医院实验动物中心提供）；抗AGE，RAGE，内皮细胞标记物（vWF），nNOS抗体（美国Abcom公司）；抗GAPDH抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；免疫组化二抗（福州迈新生物技术开发有限公司）；荧光二抗alexa fluor 594（美国invitrogen life公司）；Messon染色试剂盒（北京罗基生物技术有限公司）；细胞凋亡试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）/脂质氧化产物丙二醛（MDA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；MP150多导电生理仪（美国Biopac公司）；稳压稳流定时电泳仪（北京六一仪器厂）；光学显微镜（德国Leica公司）；荧光显微镜（德国Leica公司）。

二、动物模型及分组

年龄8周的健康Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，体质量200～250g，由北京大学第一医院提供。随机选取10只大鼠为正常对照组（NC组），其余20只大鼠造糖尿病模型，腹腔注射STZ，检测血糖确认18只成模大鼠后饲养8周。设糖尿病对照组（DM组）9只、胰岛素治疗组（DM+Insulin组）9只。胰岛素每次2～6个单位，一天2次腹腔注射，并早晚检测控制血糖。治疗4周。处死，取材。用0.3%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉采血送检，解剖分离阴茎组织。将部分组织固定在用0.1mol/L的PBS配制的、含有2%甲醛和0.002%苦味酸的固定液中4h，浸泡在30%蔗糖中4℃过夜。另一部分置于冻存管液氮保存。

三、海绵体内压（ICP）和平均动脉压（MAP）检测

戊巴比妥钠腹腔麻醉后大鼠仰卧位固定在手术台。备皮、消毒，下腹部正中切口，切开包皮暴露阴茎海绵体，穿刺阴茎海绵体成功后和Biopack电生理仪连接检测ICP。游离左侧颈总动脉，穿刺成功后和Biopack电生理仪连接检测MAP。游离前列腺后外侧，显微手术镜下寻找盆神经节，尽量游离阴茎海绵体神经，以多导电生理仪刺激器以10Hz的参数刺激阴茎海绵体神经60秒。记录ICP和MAP值。

四、SOD和MDA检测

全细胞蛋白提取试剂盒提取蛋白，检测蛋白浓度并按实验分组标记。SOD活性检测通过WST法（Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST -1）既基于WST-1的显色反应，通过比色（用酶标仪在450nm测定吸光度）来检测蛋白样品中SOD活性，严格按试剂盒说明书操作并公式计算。MDA含量检测通过MDA和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）反应产生红色产物的显色反应，随后通过比色法（用酶标仪在532nm测定吸光度）对蛋白样品中MDA进行定量检测，严格按试剂盒说明书操作并公式计算。

五、组织染色及细胞凋亡测试

石蜡切片（3μm），标记实验编号；常规脱蜡；PBS清洗后，使用Masson试剂盒。冰冻切片包埋剂（opti-mum cutting temperature compound，OCT）包埋后切片（5μm）。洗掉OCT，PBS清洗后，使用细胞凋亡试剂盒。各项操作规程严格按照试剂盒说明书执行。

六、蛋白印迹法测定

全细胞蛋白提取试剂盒提取蛋白，检测蛋白浓度并按实验分组标记。将样品放入钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭后加入一抗（RAGE 1:200）4℃过夜，次日加入二抗，电化学发光后通过Molecular Analyst图像分析软件每条条带的整合密度值（Integrated density value，IDV）。

七、免疫组化

石蜡切片（3μm），标记实验编号；常规脱蜡；放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）中抗原热修复；0.3%过氧化氢甲醇溶液孵育20min封闭内源性过氧化物酶；滴加正常山羊血清封闭，室温30min；倾去血清，滴加一抗（AGE与PBS 1:500；nNOS与PBS 1:500）4℃孵育过夜，次日倾去一抗PBS清洗后加入二抗；DAB显色；苏木素核染色；脱水，透明，中性树胶封片

八、免疫荧光

冰冻切片包埋剂包埋后切片（5μm）。洗掉OCT，0.3%Triton-100打孔20min，PBS清洗3次，10%正常羊血清封闭30min，vWF抗体与PBS 1:500混合后4℃孵育过夜，次日倾去一抗加入荧光二抗alexa fluor 594（避光）1h，清洗后染DAPI，封片。

九、统计分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，两组间的差异比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、胰岛素治疗后对于糖尿病大鼠一般状态及ICP/MAP的影响

各组间初始体质量和初始血糖差异均无统计学意义（P＞0.05）。与NC组相比，DM组最终体质量显著降低，与DM组相比较，DM+Insulin组显著增高且具有统计学意义（P＜0.01），DM+Insulin组与NC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。DM组最终血糖与糖化血红蛋白显著增高，与DM组相比较DM+Insulin组这两项显著改善，差异具有统计学意义（P＜0.01）（表1），DM+Insulin组与NC组比较，这两项差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 胰岛素对DMED大鼠体质量、血糖及糖化血红蛋白的影响

勃起功能检测以ICP/MAP进行比较，DM组测得ICP/MAP显著低于NC组（P＜0.01），与DM组相比较，DM+Insulin组明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1），但DM+Insulin组仍低于NC组（P＜0.01）。

图1 胰岛素治疗对DMED大鼠勃起功能（ICP/MAP）影响

DM-1nsulin组大鼠血糖和糖化血红蛋白虽然得到有效控制达到正常水平，且勃起功能（以ICP/ MAP检测）比较DM 组有所改善，但是比较NC组显著降低。

二、胰岛素治疗对vWF、背神经组织DMED阴茎海绵体nNOS表达及平滑肌的影响

图2 胰岛素治疗对DMED大鼠阴茎海绵体vWF、nNOS、平滑肌/胶原比例及细胞凋亡指数

由图2可见，DM组内皮细胞标记物vWF、背神经组织nNOS及平滑肌/胶原比例表达显著低于NC组（P＜0.01），与DM组相比较DM+Insulin组增高（P＜0.05），但仍显著低于NC组（P＜0.01）。细胞凋亡指数与NC组相比，DM组凋亡指数显著升高，与DM组相比较DM+Insulin组降低（P＜0.05），但仍显著高于NC组（P＜0.01）。

三、胰岛素治疗对DMED大鼠阴茎海绵体糖基化终末产物AGE及其受体RAGE表达的影响

由图3可见，发现与NC组相比，DM组AGE及RAGE表达量显著增高，与DM组相比较DM+Insulin组下降明显（P＜0.01），但仍显著低于NC组（P＜0.01）。

四、胰岛素治疗对SOD和DMED大鼠阴茎海绵体MDA水平的影响

由图4可见，与NC组相比，DM组SOD活性显著降低（P＜0.01），MDA含量显著增高（P＜0.01），与DM组相比较DM+Insulin这两项均有改善（P＜0.05），但尚未恢复到NC组水平（P＜0.01）。

讨 论

图3 胰岛素治疗对DMED大鼠阴茎海绵体AGE及其受体RAGE表达变化情况

图4 胰岛素治疗对DMED大鼠阴茎海绵体SOD活性与MDA含量变化情况

阴茎海绵体平滑肌松弛在阴茎的勃起和勃起维持功能中起主导作用。多种性刺激经过神经-内分泌-血管协调，使阴茎海绵体内血流量增加，平滑肌舒张使血窦内血流量进一步增加，海绵体内压的增加压迫白膜下静脉阻断血液流出而使阴茎坚硬勃起[8]。勃起功能障碍（ED）的定义是性刺激下阴茎勃起硬度不足以插入阴道或勃起维持时间不足以完成满意的性生活。前期ED的动物实验研究表明，利用单次腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导大鼠DM模型，两月后即引起ED，发现阴茎海绵体内糖基化终末产物堆积、氧自由基增加、平滑肌减少，胶原纤维增多，阴茎海绵体内皮细胞缺失、结构紊乱，出现断裂，阴茎神经纤维肿胀含量减少，网状纤维和弹力纤维表达异常等病理变化[4,9]。我们在组织学变化中发现糖尿病过程中糖基化终末产物AGE及其受体RAGE表达显著增高，且海绵体内皮细胞、神经、平滑肌损伤明显，平滑肌/胶原比例显著降低。

过去认为，糖尿病患者利用胰岛素等药物有效控制血糖可防治糖尿病合并症，糖尿病控制和并发症试验（DCCT）、英国糖尿病前瞻性研究（UKPDS）及其后续研究均提示：单纯利用胰岛素严格控制血糖虽然可以使血糖与糖化血红蛋白达到正常水平，但不足以完全阻断糖尿病合并症的发生和进展[5,6,10]。Cho等研究报告严格控制血糖可以将ICP/MAP恢复到正常水平，严格控制血糖组与正常组相比，凋亡指数无明显差异[11]。本研究发现，严格控制血糖后勃起功能、组织学变化，组织细胞凋亡指数得到部分改善，然而其改善程度只是正常对照组水平的50%左右。并观察到胰岛素治疗后血浆血糖水平和糖化血红蛋白水平虽然得到有效控制，但是不能显著清除阴茎海绵体组织中AGE/RAGE表达，这与引起氧化应激相关SOD降低，MDA表达增加，引起阴茎海绵体平滑肌／胶原纤维表达比例减少、内皮细胞标记物（vWF）和勃起神经标记物nNOS表达降低，细胞凋亡指数增加等病理变化显著相关。

自上世纪80年代起，“糖尿病代谢记忆”研究逐渐得到人们重视，目前对糖尿病代谢记忆的发生机制尚未完全了解，相关研究提示可能与糖基化终末产物（AGE）及其受体（RAGE）、氧化应激（ROS）及表观遗传学改变等有关[12,13]。因此，控制体内AGE、RAGE、ROS含量有望成为控制糖尿病及其并发症的重要突破点。Usta等研究表明，单纯使用AGE抑制剂ALT-711治疗可以逆转糖尿病引起的ED[14]。近期研究表明，天然药物淫羊藿中分离的单体淫羊藿苷（Icariin，ICA）、淫羊藿次苷（Icariside Ⅱ，ICA Ⅱ）对高血糖水平下DMED具有防治效果，发现糖尿病大鼠勃起功能均显著改善，组织AGE、RAGE水平显著下降，减少细胞的凋亡，降低氧化应激水平，进而逆转糖尿病性勃起功能障的组织病理改变达到接近正常水平[15]。因此，DMED利用胰岛素有效控制血糖的同时配伍使用ICA或ICAII可能更有效地防治DMED。

本实验结果提示，利用胰岛素严格控制糖尿病大鼠血糖水平，可部分改善阴茎勃起功能和阴茎海绵体病理变化，但是不能完全防治勃起功能障碍合并症。这种不完全可逆性病理变化可能与虽然胰岛素可以严格控制血糖，但是糖基化终末产物AGE及其受体RAGE仍然较高水平存在于阴茎组织中，并诱发氧化应激导致不可逆性内皮细胞功能障碍及神经病变有关，即“糖尿病代谢记忆”现象有关。这提示我们糖尿病过程中在严格控制血糖的前提下需要配伍使用AGE清除剂或ICA或ICAⅡ等药物，可能有效防治或延缓糖尿病合并症。这有待于进一步深入研究。

1 Shabsigh R, Klein LT, Seidman S,et al. Increased incidence of depressive symptoms in men with erectile dysfunction.Urology1998; 52(5): 848-852

2 Fedele D. Therapy Insight: sexual and bladder dysfunction associated with diabetes mellitus.Nat Clin Pract Urol2005; 2(6): 282-290; quiz 309

3 Israilov S, Shmuely J, Niv E,et al.Evaluation of a progressive treatment program for erectile dysfunction in patients with diabetes mellitus.Int J Impot Res2005; 17(5): 431-436

4 Van Den Eeden SK, Sarma AV, Rutledge BN,et al. Effect of intensive glycemic control and diabetes complications on lower urinary tract symptoms in men with type 1 diabetes:Diabetes Control and Complications Trial/ Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications (DCCT/EDIC)study.Diabetes Care2009; 32(4): 664-670

5 Ratzmann KP. [Therapeutic strategy for type 2 diabetes--clear outcome.Resultsof the United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS)].Fortschr Med1999; 117(5): 45-46

6 Writing Team for the Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. Sustained effect of intensive treatment of type 1 diabetes mellitus on developmentand progression of diabetic nephropathy: the Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications (EDIC) study.JAMA2003; 290(16): 2159-2167

7 Navarrete RV, Munoz JG, Martin LL,et al.Metabolic syndrome and erectile dysfunction.Arch Esp Urol2010; 63(8): 673-678

8 Kirby RS, Lue TF. An atlas of erectile dysfunction (Second edition). International Publishers in Medicine, Science & Technology 2004.

9 Zhou F, Li GY, Gao ZZ,et al. The TGF-β1/Smad/CTGF pathway and corpus cavernosum fibrous-muscular alterations in rats with streptozotocin-induced diabetes.J Androl2012; 33(4): 651-659

10 Chrisholm DJ. The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT). A milestone in diabetes management.Med J Aust1993;159(11-12):721-723

11 Cho SY, Chai JS, Lee SH,et al. Investigation of the effects of the level of glycemic control on erectile function and pathophysiological mechanisms in diabetic rats.J Sex Med2012; 9(6): 1550-1558

12 Zhang L, Chen B, Tang L. Metabolic memory: Mechanisms and implications for diabetic retinopathy.Diabetes Res Clin Pract2012; 96(3): 286-293

13 Lander HM, Tauras JM, Ogiste JS,et al. Activation of the receptor for advanced glycation end products triggers a p21(ras)-dependent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxidant stress.J Biol Chem1997; 272(28): 17810-17814

14 Usta MF, Kendirci M, Gur S,et al. The breakdown of preformed advanced glycation end products reverses erectile dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats: preventive versus curative treatment.J Sex Med2006; 3(2): 242-250; discussion 250-252

15 Zhou F, Xin H, Liu T,et al. Effects of icariside II on improving erectile function in rats with streptozotocininduced diabetes.J Androl2012; 33(5): 832-844

（2013-12-25收稿）

Protective effects of insulin on erectile function in rats with streptozotocin-induced diabetes*

Tian Wenjie1, Wang Lin2, Li Huixi2, Lei Hong'en2, Guan Ruili2, Xu Yongde2, Na Wanli1**, Xin Zhongcheng2**
1. Department of Urology, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Jilin University, Jilin 130033, China
2. Andrology Center, Department of Urology, First Hospital, Peking University

Na Wanli, E-mail: E-mail: nwl_12@163.com; Xin Zhongcheng, E-mail: E-mail: xinzc@bjmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of insulin on eretile dysfunction in a rat model with streptozotocin-induced diabetes.MethodsThe diabetic erectile dysfunction (DMED) rat model was made by injecting the male 8-week-old Sprague-Dawley rats intraperitoneally with vehicle or freshly prepared 60 mg/kg streptozocin, and blood glucose level was measured in the later experiments. Then the rats were divided into three groups: the normal control group (N), the diabetes group (DM) and the diabetes plus insulin therapy group (DM+Insulin). 8 weeks after STZ injection, the DM+Insulin group were treated with 2～6 units of neutral protamine Hagedorn twice a day for 4 weeks through subcutaneous injection. After the f nal treatment, all rats were tested for erectile function by measuring the intracavernous pressure and mean arterial pressure (ICP/MAP), and the penile was harvested for histology study.ResultsAlthough the glycemic level was tightly controlled by insulin in the therapy group, ICP/MAP level was partially restored compared to that of the normal control group, so with the endothelial and smooth muscle contents and apoptosis index.ConclusionInsulin could partially restore the erectile functions and pathology changes in the streptozotocin-induced diabetes rat model. Further studies are needed to investigate the underlying mechanisms in the processes of diabetic erectile dysfunction.

erectile dysfunction; diabetes mellitus; insulin

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.002

R 698.1; R 587.1

资助: 国家自然科学基金资助项目 （编号81270693）

**共同通讯作者: 那万里, E-mail: nwl_12@163.com; 辛钟成, E-mail: xinzc@bjmu.edu.cn