茯苓多糖体外对小鼠精子膜及DNA的保护作用*

张美华邱 毅**董云玲王磊光孙士青

1. 国家卫生和计划生育委员会生育调控技术重点实验室,

山东省计划生育科学技术研究所（济南 250002）; 2. 山东省科学院生物研究所

茯苓多糖体外对小鼠精子膜及DNA的保护作用*

张美华1邱 毅1**董云玲1王磊光1孙士青2

1. 国家卫生和计划生育委员会生育调控技术重点实验室,

山东省计划生育科学技术研究所（济南 250002）; 2. 山东省科学院生物研究所

目的观察茯苓多糖体外对小鼠精子膜功能、精子DNA 和存活率的保护作用。方法 取小鼠精子制备精子悬液，并分为正常组（PBS），生理盐水组，维生素C组（阳性药对照组）和茯苓多糖低、中、高剂量组（0.5mg/mL，1.0mg/mL和5.0mg/mL）。各对照物及茯苓多糖分别与精子悬液共同孵育后，检测精子膜完整性、DNA损伤程度及存活率，通过精子全部低渗膨胀试验（HOS）评估精子膜功能，精子染色质扩散(SCD)实验检测精子DNA完整性，并与已知的抗氧化剂维生素C对照。结果低、中、高浓度的茯苓多糖在相同的条件下均可增加精子存活时间，提高精子存活率和活力，降低精子DNA损伤比率，对精子膜功能和DNA均具有一定的保护作用。其中1.0mg/mL和5.0mg/mL（中、高）的茯苓多糖组作用明显优于维生素C组（P＜0.05或P＜0.01）。结论茯苓多糖对小鼠精子膜和DNA有明显的保护作用，并可延长精子的体外存活时间。

茯苓多糖; 体外; 精子; 小鼠

人类辅助生殖技术（ART）中体外精液处理优选精子是治疗少弱畸精子症的常用方法，通过该方法可以获得没有精浆、细胞碎片及病原微生物污染的精子悬液，回收足够数量具有正常形态和功能的精子进行宫腔内人工授精（IUD）[1-4]。目前所用的精子营养液仍有待改进，我国所用的大多为进口产品，价格昂贵。传统的中草药作为我国人民长期积累的经验和总结，有巨大的开发价值和潜力[5,6]。茯苓（Poria Cocos, PC）为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，性甘、淡、平，归心、肺、脾、肾经，茯苓多用于组合方剂中，临床主要用于水肿尿少，痰饮眩悸，脾虚食少，便溏泄泻，心神不安，惊悸失眠等。我们前期研究显示，茯苓、麦冬等中药具有较好的体外活化精子作用，申报发明专利已获受理和授权。本文应用茯苓多糖进行体外小鼠精子孵育，观察茯苓多糖对精子膜及精子DNA的作用，尚未见研究报道。

材料和方法

一、茯苓中药材选取及多糖制备

干燥茯苓（购自山东省济南市建联中药店），称取1000 g，粉碎机粉碎后过60目筛，加超纯水10 L，中药提取分离，浓缩，蒸发水分，获得茯苓粗提物620 g。

参考赵子剑方法[7]。称取茯苓粗提物100 g置500 mL圆底烧瓶中，加石油醚250 mL于60～90℃回流1h脱脂，滤过，石油醚回收。滤渣挥干溶媒后以80%乙醇250 mL浸渍过夜，80～90℃回流提取2次，每次1.5h，滤过，药渣加蒸馏水500mL浸1h后于90℃温浸提取40min，滤过，再用250mL蒸馏水90℃温浸30min，过滤，合并滤液，减压浓缩至75mL。脱去蛋白质，加1%活性炭脱色2次，抽滤，滤液加95%乙醇使含醇量达80%，冰箱静置过夜。过滤，残渣依次用95%乙醇、无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤后于60℃烘干，得褐色茯苓粗多糖。茯苓多糖的分离纯化：用蒸馏水洗脱DEAE纤维素柱得到一个茯苓多糖组份，再用0～0.2mol/L氢氧化纳进行梯度洗脱，上凝胶过滤柱6次，共上样15g，收集多糖洗脱液，于流水中透析3d，真空冷冻干燥后得精制茯苓多糖10.9 g白色固体。1g茯苓多糖加生理盐水10mL，配置成100.0 mg/mL的茯苓多糖液，-20℃备用。实验时临时配置成0.5mg/mL，1.0mg/mL和5.0mg/mL（低、中、高）3种不同浓度。

二、方法

（一）正常精子悬液制备

选取SPF级KM雄性成年小鼠36只（由山东省疾病预防控制中心提供），取小鼠双侧附睾，置于37℃预温的缓冲液（PBS）中，洗去毛发和血液，转至有20 mL PBS的培养皿中，剪开附睾头部，待精子充分游离后，将上清液用200目滤网过滤，反复操作至上清液变清，计数板计数，用3 mL PBS调整细胞浓度为20×106个/mL备用（置37℃）。

（二）分组

分为6组：正常组、生理盐水（对照）组、维生素C（阳性药对照）组和茯苓多糖液低、中、高 3个剂量组。每组各取0.2mL精子浓度为20×106个/mL的游离的小鼠精子悬液样本，加入等量的对照样品及茯苓多糖液溶液。正常组加入等量的PBS；生理盐水组加入等量的生理盐水；维生素C组终浓度为0.25 mg/ mL，加入等量的维生素C溶液；茯苓多糖液低、中、高3个剂量组，分别加入等量的0.5mg/mL，1.0mg/mL和5.0mg/mL茯苓多糖液。置37℃，5%CO2培养箱中孵育2.0 h及24.0 h。

（三）曙红-Y染色试验检测精子存活率

称取0.5g曙红-Y（HGB3395-60，上海试剂三厂）及0.1g吉姆萨（Q/GHSC1092- 1999，上海试剂三厂），加入0.9%的生理盐水至100mL混匀，充分溶解，配置成0.5%的曙红-Y染液（EY），双层滤纸过滤，滤液室温保存备用。经温育24h后的精子悬液与等量的EY染液，室温下放置2 min，加盖玻片，在明视野400×显微镜下15 min内观察，死精子被染色呈粉红色，活精子不被染色而胞质透明，详细方法见邱毅等报道[8]。每份标本计数200个精子计算存活率。

（四）EY结合精子尾部低渗肿胀检测精子膜完整性

称取0.735g柠檬酸钠和1.35g果糖，加双蒸水至100 mL，配置成离子强度为0.15，渗透压150 mOsm的低渗液。取0.1mL小鼠精子悬液，加入1mL 150 mOsm的低渗液中，混匀，37℃水浴30min后，加入0.1mL的EY染液，混匀。2 min后吸取50μl精液-HOS-EY混合液滴在清洁载玻片上，加盖22mm ×22mm盖玻片湿片封片，显微镜（Olympus, IX51, Japan，×400，和Leica, DM4000B, Germany, × 1000）下观察每条精子头部着色和尾部肿胀情况，随机计数200条精子，计算4种类型精子的百分率。A型：尾肿胀（HOS+）-头未染红色（EY -），判断为尾膜-头膜均完整的精子。B型：尾不肿胀（HOS异常）-头未染红色（EY-），判断为尾膜损伤-头膜完整的精子。C型：尾肿胀（HOS+）-头红染（EY+），判断为尾膜完整-头膜损伤的精子。D型：尾不肿胀（HOS-）-头红染（EY+），判断为尾膜—头膜均损伤的精子。详细方法见邱毅等报道[1,2,5]。

（五）精子染色质扩散（sperm chromatin dispersion test, SCD）实验

根据Qiu等[1,2]方法进行SCD实验。（1）小鼠精子悬液标本用PBS稀释到10×106/mL，取0.2mL与琼脂凝胶按1:1比例混匀，放置在1.5mL的Eppendorf管内，37℃孵育。（2）吸取50μl以上配置的小鼠精子悬液放置在用80℃下干燥的琼脂浇制的载玻片上，盖上盖玻片放置4℃ 4min。（3）去除盖玻片，22℃下放入0.08mol/L的HCl内7min，室温下加入0.4mol/L的Tris，0.8mol/L的 DTT，1%的SDAS，5min。（4）标本片放入0.09mol/L的Tris和0.002mol/L的EDTA冲洗2min。（5）标本片放入70%、90%和100%的乙醇中脱水。（6）空气中自然干燥后加入DAPI染色，荧光显微镜（Nikon-E1000，日本）下观察结果。加入瑞-吉氏染液后自然光显微镜下观察精子。（7）结果判断标准：计数500个精子，观察精子光晕大小。分为大、中、小和无光晕4个等级，大和中光晕表示精子DNA完整无碎片，小和无光晕表示精子DNA断裂为碎片。小光晕以≤精子头直径（精子头裂解后）1/4为判定标准，中光晕＞精子头直径1/4而≤精子头直径2/3，大光晕＞精子头直径2/3。

结 果

一、茯苓多糖对精子存活率的影响

精子悬液孵育2h及24h后各组的精子存活率比均有降低。维生素C组和茯苓多糖低、中、高剂量组的精子存活率显著高于生理盐水组（P＜0.01）；茯苓多糖低剂量组与维生素C组无明显差异，茯苓多糖中、高剂量组的精子存活率显著高于维生素C组（P＜0.05及P＜0.01）（见表1）。

二、茯苓多糖对精子膜及DNA完整性的影响

36例小鼠附睾游离精子悬液分别加入生理盐水、维生素C和茯苓多糖低、中、高剂量孵育2h及24h后各组的精子，A型、B型、C型和D型精子以及精子DNA碎片比例如表2所示。茯苓多糖低剂量组与维生素C组相比无显著性差异，中、高剂量组显著高于维生素C组（P＜0.01），甚至接近正常组； A型和B型精子为0，C型精子比对照组明显减少，D型精子比对照组明显增加（P＜0.01）。精子DNA碎片比例茯苓多糖低剂量组与维生素C组无明显差异，但低于对照组和生理盐水组，茯苓多糖中、高剂量组的精子DNA碎片低于正常组、生理盐水组及维生素C 3组（P＜0.05及P＜0.01）（见表2）。

表1 各组2h及24h后EY检测精子存活率（±s）

表1 各组2h及24h后EY检测精子存活率（±s）

与对照组比较,*P＜0.05，**P＜0.01; 与生理盐水组、维生素C组及低剂量茯苓多糖组比较，△P＜0.01

精子存活率(%)组别 n 剂量(C/mg•ml-1) 2h 24h正常 36 - 47.9±5.3 1.2±0.3生理盐水 36 - 43.2±6.1 1.4±0.1维生素C 36 0.25 38.5±5.3 3.5±0.1*茯苓(低) 36 0.5 41.0±3.9 2.8±0.6*茯苓(中) 36 1.0 47.1±5.1 16.7±1.7**△茯苓(高) 36 5.0 47.2±3.6 18.2±1.2**△

表2 茯苓提物及维生素C体外孵育24 h后对小鼠精子膜及DNA的影响（n=36，±s）

表2 茯苓提物及维生素C体外孵育24 h后对小鼠精子膜及DNA的影响（n=36，±s）

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01; 与生理盐水组、维生素C组及低剂量茯苓多糖组比较，△P＜0.01

HOS-EY后精子膜改变类型 (%) SCD (%)剂量(C/mg•ml-1) A B C D DNA碎片对照组 - 9.4±1.3 2.6±0.5 40.2±1.7 47.8±2.1 11.8±1.2生理盐水 - 8.5±1.2*2.5±0.8 40.0±2.1 49.0±3.1*12.1±1.1维生素C 0.25 10.0±1.6 2.0±0.7 41.4±5.1 46.6±3.2*10.9±1.0**茯苓(低) 0.5 10.9±1.5*2.1±0.6 41.3±4.1 45.7±4.9*9.5±1.2**△茯苓(中) 1.0 12.3±1.8**△2.7±0.6 40.0±3.1 45.0±3.2**△8.6±1.1**△茯苓(高) 5.0 13.9±1.3**△2.1±0.7 39.5±3.1 44.5±3.2**△7.9±0.8**△

讨 论

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，多寄生于马尾松或赤松的根部。茯苓是一味使用历史悠久的传统中药，其性平，味甘、淡，具有利水渗湿、健脾和胃、宁心安神的作用，中医主要用其治疗小便不利，水肿，脾胃气虚，食少便溏，体倦乏力以及心神不宁，惊悸，失眠等症。现代药理学研究表明茯苓具有肿瘤抑制、免疫增强、抗炎等多方面的药理作用；其主要化学成分为多糖和三萜。对于脾虚运化失常所致泄泻、带下，应用茯苓有标本兼顾之效。现代中医研究显示，茯苓能祛斑增白、润泽皮肤，扩张血管，还可以增强免疫功能和抗肿瘤，茯苓多糖对小鼠肉瘤有抑制作用，其作用与胸腺有关，可激活局部补体。茯苓无毒副作用，是一种药食兼备的真菌。枸杞子、茯苓、山楂是3种最常用的既是食品又是药品的原料。茯苓饼既桂香浓郁，又营养丰富，且有安神益脾等滋补之功。茯苓多糖能显著降低动物体内自由基水平，提高动物体内自由清除酶的活力，提高动物耐寒和抗疲劳能力，说明茯苓多糖具有较好的抗衰老作用[7]。 但其体外活化精子作用尚未见有研究报道。

菌类中所含的有效成分，以多糖最为引人瞩目，多糖又称为聚糖，由单糖聚合而成，其相对分子质量一般为数万甚至达到百万，广泛存在于植物的细胞壁中，是构成生命的四大物质之一。临床研究显示，茯苓多糖对鼻咽癌、胃癌有一定疗效，它能通过影响巨噬细胞、淋巴细胞及其他细胞、体液因子协同杀灭肿瘤细胞，其原理与激活机体的肿瘤免疫监测系统，影响肿瘤细胞的分裂与增殖，抑制DNA复制，干扰DNA或介导DNA断裂，导致肿瘤细胞凋亡有关[7,9]。茯苓多糖体外对精子的活化有较明显的作用，尚未见研究报道。

本实验表明，茯苓多糖体外对小鼠精子膜及精子DNA具有保护作用，可能是其增强精子的活动能力，延长精子体外存活时间的主要作用机制。尽管茯苓以复方形式多次出现在治疗男性少精子、弱精子症不育的中药配伍中，但就其所发挥作用的机制研究尚不全面，尤其在研究其体外保护精子功能方面还是新的尝试。茯苓多糖的作用呈剂量依赖性，中、高剂量（1.0 mg/mL及5mg/mL）时对精子存活时间延长较为显著，是正常组（不加药物，只加PBS）的12～15倍（1.4/16.7-18.2），而维生素C也可明显延长小鼠精子的体外存活时间，与茯苓多糖低剂量组效果相同，但明显低于茯苓多糖中、高剂量组。

本实验结果显示，适量茯苓多糖能显著提高小鼠精子体外存活率，减少小鼠精子膜及DNA的损伤，对精子膜结构和功能具有明显的保护作用，有可能在治疗弱精子症不育患者时，为体外处理及活化精子提供很好的精子营养液，为治疗弱精子症男性不育开辟新的途径。

1 Qiu Y, Wang LG, Zhang LH,et al. Sperm chromosomal aneuploidy and DNA integrity of infertile men with anejaculation.J Assist Reprod Genet2012; 29(2): 185-194

2 Qiu Y, Wang LG, Zhang LH,et al. Quality of Sperm Obtained by Penile Vibratory bratory Stimulation and Percutaneous Vasal Sperm Aspiration in Men with Spinal Cord Injury.J Andrology2012; 33(5):1036-1046

3 World Health Organisation. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction, 4th ed, New York: Cambridge University Press. 1999

4 Qiu Yi, Wang SM, Yang DT,et al. Percutaneous vasal sperm aspiration and intrauterine insemination for infertile males with anejaculation.Fertil Steril2003; 79(3): 618-620

5 Qiu Y, Wang LG, Jia YF,et al. The effects of the extract of Chinese Polygala tennuidolia willd on human sperm in vitro.J Zhejiang Univ Sci B2011; 12(6): 448-454

6 邱毅, 王磊光, 贾颐舫, 等. 桔梗粗提物及桔梗皂苷D体外杀精子活性机制研究. 中华医学杂志 2010; 90(44): 3107-3111

7 赵子剑. 茯苓多糖的提取方法优选. 时珍国医国药2009; 20(9): 2207-2208

8 邱毅, 王磊光, 张丽红, 等. 男性不育患者精子染色体畸变及精子DNA完整性分析. 中华医学遗传学杂志2008; 25(6): 681-685

9 石延榜, 赵娟, 贺海花. 茯苓饮片规格的研究. 中国实用医药 2008; 8(12): 200-201

（2013-12-25收稿）

Effects of pachyman from Poria cocos on mouse sperm membrane and DNAin vitro*

Zhang Meihua1, Qiu Yi1**, Dong Yunling1, Wang Leiguang1, Sun Shiqing21. Key Laboratory for Improving Birth Outcome Technique, Shandong Institute for Family Planning, Jinan 250002, China;
2. Biology Institute of Shandong Acadamy of Sciences

Qiu Yi, E-mail: Email: qiuyi987@sina.com

ObjectiveTo explore the protective effects of crude extract from Poria cocos on mouse sperm membrane, sperm DNA and viabilityin vitro.MethodsMice sperm suspension was prepared in PBS, and divided into normal group (PBS), and normal saline group, positive control group (vitamin C) and the low, medium and high dose group(treated with crude extractings from poria cocosuse using a dose of 0.5mg/mL, 1.0mg/mL and 5.0 mg/mL). After the sperms were incubated with the crude extracts, their DNA damaged level and membrane integrity were detected by the improved Eosin-Y (EY) staining, hypo-osmotic swelling (HOS) test and the sperm chromatin dispersion (SCD) test respectively.ResultsThe low, medium and high dosage of crude extractings all prolonged sperm survival time and improved the sperm vitality, reduced the percentage of sperm DNA damage in vitro. Of which, middle and high dose of crude extractings were signif cantly better than vitamin C group in sperm vitality and sperm DNA damaged level (P<0.05 orP<0.01).ConclusionThe crude extracts from poria cocos had signif cant protective effects on mice sperm membrane and DNA.

pachyman from Poria cocos; in vitro; spermatozoa; mice

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.003

R 321.1

资助: 本项目为山东省自然科学基金资助（基金号：ZR2010HM016）**

, Email: qiuyi987@sina.com